干扰素的生产与行

干扰素的生产工艺与市场分析主要内容1干扰素简介2干扰素生产工艺的发展3基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺4国内基因工程药物产业发展状况5干扰素制品国内市场的现状与发展分析1干扰素简介1.1干扰素的定义干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称Interferon，简称IFN。α1b1.2干扰素的发现干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。1.3天然干扰素的分类1.根据来源、基因序列和氨基酸组成分类◆I型干扰素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长、免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。◆II型干扰素：干扰素γ（IFN)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2.根据动物来源确定分类人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药证书。研发中的重组干扰素：IFNω，临床阶段α2aα2b1.4干扰素的作用机制干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2′-5′A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。①间接性：通过诱导细胞产生抗病毒蛋白等效应分子抑制病毒。②广谱性：抗病毒蛋白是一类酶类，作用无特异性。对多数病毒均有一定抑制作用。③种属特异性：一般在同种细胞中活性高，对异种细胞无活性。④发挥作用迅速：干扰素既能中断受染细胞的病毒感染又能限制病毒扩散。在感染的起始阶段，体液免疫和细胞免疫发生作用之前，干扰素发挥重要作用。不同来源的干扰素1.5重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ1.6干扰素适应症目前使用干扰素治疗的主要对象是慢性乙型和丙型肝炎的病人，而且在乙型肝炎病人中，有以下情况应用干扰素治疗反应较好1.治疗前血清ALT或AST有反复波动或酶的活力持续升高者；2.治疗前血清HBeAg的P/N值偏低(P/N5～8)或HBVDNA水平低(100Pg/ml)者；3.病程较短者；4.肝脏病理有活动性炎症病变(如有碎屑样坏死)者疗效佳；5.无重叠感染者(如丙型、丁型肝炎等)；6.无HIV感染或免疫抑制剂治疗者；7肝组织内含铁量低者；8.治疗期间血清中无干扰素中和抗体产生者9.女性患者疗效比男性为佳。2干扰素生产工艺的发展干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：1999年：IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:干扰素生产工艺路线（4）上市产品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：干扰素生产工艺路线（5）•宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）•上市产品：IFNα-2b/安福隆•表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性•工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺3基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺3.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立第一步：干扰素α-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第二步：表达载体构建•IFN基因与表达载体连接•转化大肠杆菌•筛选阳性克隆•获得序列正确表达载体第三步：工程菌构建转化假单胞杆筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种3.2干扰素α-2b的发酵工艺过程（1）摇瓶培养取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。（2）种子罐培养接种：接入50L种子罐，接种量10%。培养：30℃，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速DO为30%，3～4h，OD4.0。检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。（3）发酵罐培养◆接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检查（4）菌体收集连续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。3.3干扰素的分离纯化工艺过程3.3.1、干扰素分离工艺过程3.3.2、干扰素的纯化工艺过程3.3.1干扰素α-2b分离工艺过程菌体裂解预处理初级分离(1)菌体裂解裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。(3)离心连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。（4）初级分离盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。3.3.2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装(1)溶解粗干扰素配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值。溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。(2)沉淀与疏水层析等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中除非疏水性蛋白洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。(3)阴离子交换层析与浓缩0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰。浓缩：调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。（4）阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱配合SDS-PAGE收集干扰素峰。浓缩：10ku超滤膜进行。(5)凝胶过滤层析洗涤液：0.15MNaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂上样，相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分(6)无菌过滤分装0.22μm滤膜过滤干扰素溶液分装－20℃以下的冰箱中保存。(7)检测项目干扰素鉴别试验干扰素效价测定蛋白质含量，纯度测定，分子量宿主残余蛋白、残余DNA干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列其他：热原，内毒素，残留抗生素4国内基因工程药物产业发展状况我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿~60亿美元。存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争，严重影响产业的健康发展。（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。5干扰素制品国内市场的现状与发展分析2006年-2009年我国干扰素需求量统计单位：千克需求量及其增长分析自1957年发现干扰素以来，40年来的研究使人们对干扰素的认识已有了根本改观，干扰素不仅是病毒间干扰现象的介质，而且是调节细胞功能的重要系统，现在已发展成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学以及肿瘤学有关的一个新兴的研究领域，随着生物工程技术的兴起，目前已广泛进入临床应用时代。05101520250%2%4%6%8%10%12%14%需求量14.0515.3217.0619.11增长率——9.04%11.36%12.02%2006年2007年2008年2009年我国干扰素区域市场需求分析华北30.4%东北12.3%华东19.6%西北10.0%西南13.6%中南14.1%我国干扰素产品结构分析干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组α-干扰素和人自然干扰素两大类。从我国市场研发情况来看，目前重组α-干扰素占据的市场比重较大，约为67.4%。重组α-干扰素67.4%人自然干扰素32.6%产量及其增长分析2006年-2009年我国干扰素产量统计单位：千克近几年我国干扰素市场一直处于供不应求的局面。0246810121416180%2%4%6%8%10%12%产量11.5212.4613.7915.36增长率——8.16%10.67%11.38%2006年2007年2008年2009年前景与展望随着人们对干扰素研究的不断深入,尤其是现代分子生物学飞速发展,人们对干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理的不断阐明,使得人们在干扰素领域取得了空前的进步。特别是干扰素的聚乙二醇化(pegylatedinterferon)和干扰素与载体