第二章-天然产物的提取分离与结构鉴定

第二章天然产物的提取分离和结构鉴定•一、基本概念•1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。•2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。第一节天然产物的提取研究天然产物化学成分的基本步骤原材料单体化合物总提取物不同部位目的化合物结构修饰人工合成提取初步分离精细分离纯化水亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂二、提取方法超临界流体萃取法（SFE）水蒸气蒸馏法溶剂提取法升华法压榨法溶剂（一）溶剂提取法溶剂提取法原理——“相似相溶”溶剂的选择取决于被提取成分化学结构、溶解性及溶剂的性质。注意：乙醇、甲醇虽然属于亲水性溶剂，可与水混溶，但很多亲脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分。•溶剂提取法•根据天然成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从生物材料中溶解出来的一种提取方法。溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程。包括浸润、解吸和扩散三个阶段。1、溶剂提取法的原理选择溶剂依据相似相溶原理。浸润：渗透阶段溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。解吸：溶解阶段细胞内容物与细胞组织之间有亲和力，溶剂破除这种亲和力。扩散：置换阶段利用细胞内的渗透力产生的压差而抽提出来，用溶剂占领内容物的位置而将内容物置换出来。•2、选择溶剂的要点*对所要成分溶解度大*沸点适中容易回收*低毒安全*廉价天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。最常用的溶剂为乙醇。3、常用溶剂的分类水及酸水或碱水等，适合提取无机盐、可溶性糖、多酚类、氨基酸、水溶性蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。1.强极性溶剂2.弱极性溶剂3.非极性溶剂亲脂性有机溶剂，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚、环己烷等。适合提取：除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉与部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成分亦可溶。通过调节乙醇浓度、加酸、加碱可改变分离效果。亲水性有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮。适合提取极性小的成分，但渗透性差，易燃、易挥发，常有毒性；样品中水分多则提取效果差水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿苯石油醚常见溶剂极性的强弱顺序：•4、溶剂的选择•(1)水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。•(2)亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。•(3)亲脂性有机溶剂：•具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。5、溶剂提取的方法溶剂提取的方法连续回流提取法回流提取法煎煮法（煎中药）渗漉法浸渍法（泡药酒）（1）浸渍特点适用于较易提取的有效成分遇热易破坏以及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的天然物的提取。适用范围特点：浸出率较差，特别是用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。粉碎好的药材放入提取用的容中，加入溶剂使没过药面，浸泡12小时。滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取加入溶剂浸泡12小时后浸渍法（2）渗漉法向原料粗粉中不断添加溶剂，使其渗过原料，从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种浸出方法。（2）渗漉特点当溶剂渗进原料溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸出液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行。原理特点：浸出效率较高，浸出液较澄清。溶剂消耗量大、费时长。（3）煎煮法以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原料也不适用。传统的中药煎制。（4）回流提取法使用有机溶剂。对遇热易破坏的成分有影响。（5）连续回流提取法索式提取器的组成循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连续提取的方法。提取效率高，节省溶剂。但不适于热不稳定成分的提取。也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇。不同比例的溶剂可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5)可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等。连续回流(索氏提取)①.把滤纸做成与提取器大小相应的滤纸筒，然后把需要提取的样品放入滤纸筒内，装入提取器。注意:a.滤纸筒既要紧贴器壁，又要方便取放。（滤纸筒上可以套一圈棉线，方便提取完成后取出滤纸筒。）b.被提取物高度不能超过虹吸管，否则被提取物不能被溶剂充分浸泡，影响提取效果。被提取物亦不能漏出滤纸筒，以免堵塞虹吸管。如果试样较轻，可以用脱脂棉压住试样。操作步骤：②.在提取用的烧瓶中加入提取溶剂和沸石（没有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸）。③.连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加热。沸腾后，溶剂的蒸气从烧瓶进到冷凝管中，冷凝后的溶剂回流到滤纸筒中，浸取样品。溶剂在提取器内到达一定的高度时，就携带所提取的物质一同从侧面的虹吸管流入烧瓶中。溶剂就这样在仪器内循环流动，把所要提取的物质集中到下面的烧瓶内。具体的回流时间是不一样的，有的是按文献要求提取一定时间，有的是提取至提取液无色，又比如用乙醚提取样品中的脂肪时是以抽提管中流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。总之就是要提取完全为止。旋转蒸发旋转蒸发薄膜蒸发6、影响溶剂提取法的因素（1）生物材料的粉碎度材料细，面积大，扩散快，效果好。但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提取。花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细些。（2）提取温度一般使用常温，在不破坏有效成分的条件下加热不要超过80˚C。温度低提取时的杂质少，温度高时提取效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水提时避免热提。（3）提取时间以提完为准，是否完全可以提取也做定性实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断。根据检测结果确定是否需要延长提取时间。（4）浓度差根据扩散原理，造成提取液的浓度差可以提高提取的效率。dxdc可采取的措施有：搅拌、更换溶剂。（5）新技术的使用超声波、微波促提技术的应用，可以加快提取速度，提高提取效率。目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率（3300W）来提高萃取效率。但较大的超声波功率，又会发出令人感觉不适的噪音。超声波促提原理：为物理过程，无化学反应，不改变生物活性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、扩散、溶解。实验室用小型超声仪工业生产用超声仪微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物从固相进入溶剂相的过程。微波促提原理：•微波加热机制：极性分子作用机制:极性分子存在一定的偶极矩，当它处于一定的静电场中时，偶极分子就有呈方向性的趋势，即带正电的一端朝向负极，带负电的一端朝向正极。当电磁场方向变化时，偶极子的取向也随之改变，分子发生摆动。当微波的频率较高时，如2450MHz，即1秒钟内电场变化2.45×109次，极性分子也随之发生2.45×109次的摆动。由于分子的热运动和相邻分子间的相互作用，阻碍和干扰分子随电场的摆动，产生类似摩擦的作用，使分子获得能量并以热的形式表现出来。加热机制微波具有穿透力强，加热效率高，操作简便、快速、节能、高效等特点。缺点：化学成分的结构易发生变化，继而导致生物活性的改变。微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物质的稳定性。工业生产用微波提取罐（二）水蒸气蒸馏法适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分结构的提取。如挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶于水但有一定挥发性的有机物质中，使该有机物在低于100℃的温度下，随着水蒸气一起蒸馏出来。原理：道尔顿分压定律水蒸气蒸馏装置常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、蒸馏、冷凝和接受器四个部分。（三）升华法装置图适用范围某些固体物质（如水杨酸、苯甲酸、樟脑等）受热后，在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可以直接转化为蒸汽，蒸汽遇冷又凝结为固体称为升华1、将茶叶与95%乙醇回流2h；2、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积；3、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗；5、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色咖啡因在滤纸上结晶。实验室提取咖啡因步骤：升华（四）超临界流体萃取在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。物质在不同温度和压力的条件下，可以以不同的形态存在，如固体，液体，气体，超临界流体等。在超临界流体中，不同的物质有不同的溶解度，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或者溶解度小的物质分开。然后，通过升高温度，降低压力或者吸附的方法，使萃取物与超临界流体分离，而得到所需的物质。原理超临界状态P-T相图气态=液态临界点:气、液界面刚刚消失的状态点(Pc、Tc)为什么超临界流体是良好的萃取剂液体超临界流体气体超临界流体的物理性质和传质特性介于液体和气体之间超临界流体的溶解能力与液体的溶解能力接近；扩散系数接近于气体液体气体超临界流体优良性能的萃取剂溶剂萃取超临界萃取溶剂残留不可避免完全无溶剂残留，纯净存在重金属无重金属溶剂的溶解能力为定值溶解能力随温度和压力变化可能使用高温，热敏物质分解通常在较低温度下，不分解存在无机盐被萃取的问题无无机盐残留溶剂选择性差选择性好需额外的操作单元来脱除溶解在线分离，有效物质收率高溶剂萃取和超临界萃取的对比最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。（三）超临界流体萃取法超临界二氧化碳流体(SFE-CO2)临界点(31.1℃)相当接近室温超临界二氧化碳萃取二氧化碳在温度高于临界温度Tc=31.26℃，压力高于临界压力Pc=7.4MPa的状态下，性质会发生变化，其密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解能力。用它可溶解多种物质，然后提取其中的有效成分，具有广泛的应用前景。超临界二氧化碳是目前研究最广泛的流体之一，因为它具有以下几个特点：(1)CO2临界温度为31.26℃，临界压力为7.4MPa，临界条件容易达到.(2)CO2化学性质不活泼，无色无味无毒，安全性好.(3)价格便宜，纯度高，容易获得.利用超临界条件下流体的特殊性能对样品进行提取，是20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。超临界流体不但具有与液体接近的密度，有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率越高。常用的超临界流体有CO2、乙烷、丙烷等。与普通有机溶剂提取法相比，超临界CO2萃取技术具有无毒、常温、不易燃、无污染等特点，可确保原有的色、香、味不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程中可同时对萃取物进行分离纯化。该技术适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分。超临界CO2提取的特点。CO2钢瓶冷温槽高压泵恒温箱控温面板接受瓶流量计CO2原料玻璃珠脱脂棉萃取柱超临界CO2萃取实验装置示意图液体CO2由高压泵加压到萃取工艺要求的压力并传送到换热器，将CO2流体加温到萃取工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过程。负载溶质的CO2流体在分离器中改变温度压力，溶解度降低使萃取物得以分离。分离萃取物后的CO2流体再经换热器液化后回到储罐中循环使用。超临界CO2提取操作流程20世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青。70、80年代SFE用于食品香料的提取。90年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分。大型超临界流体萃