2-1寻找天然药物有效部位的基本方法

1寻找天然药物有效部位的基本方法一、天然药物活性成分研究的途径实地调查、文献调查↓原植物鉴定和处理↓成分预实验↓提取分离↓活性筛选↓↓有效部位有效成分↓分离,活性筛选↓有效成分↓↓↓↓结构修饰←←←←结构鉴定和测定→→→→药理、毒理研究↓↓↓→→→→→→→→临床实验←←←←按一类新药的研究途径↓新药二、天然药物有效部位或化学成分的分离(溶剂极性依次递增分离法)1．将天然药物干燥样品置于连续回流提取器中，依次用石油醚、乙醚(或氯仿)、醋酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇(或甲醇)、水回流提取，将其按极性由小至大分成七个部分，各部分分别回收溶剂后用蒸馏水或者低浓度的药理试验允许的有机溶剂(如乙醇、丙二醇)稀释、调正体积，作成水溶液或混悬液，灌封于安瓿中供药理筛选用。这七个部分所含化学成分大体如下：①油脂、蜡、叶绿素、萜类、甙元等脂溶性成分；②生物碱、甙元、酚性物、内酯等；③亲脂性甙类(单糖甙)、酚性成分等；④多数甙类、有机酸等；⑤氨基酸、鞣质、部分单糖类、水溶性生物碱等；⑥糖类、氨基酸、小分子肽类；⑦蛋白质、多糖、多肽、粘液质等。2．将天然药物先用水煎煮，滤液浓缩成1：1或1：2体积后，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分成氯仿液、乙酸乙酯液。正丁醇液和水溶液四部分，回收溶剂，并挥尽溶剂后调正体积，灌封供药理筛选用。这种提取分离方法特别适用于经典传统方剂中药物有效部位的筛选；因为古典方剂大多数都是汤剂有效，这样既方便且易寻找到有效部位。3．★将天然药物粉碎，置连续回流提取器中，用70％～95％的乙醇回流提取，然后回收乙醇、加水至1：1体积，再分别用石油醚、氯仿(或乙醚)、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分取有机层。得五个部分，所得五个部分大体的成分为:①石油醚部分：油脂、叶绿素、亲脂性甙元、甾醇等；②氯仿部分：生物碱、多数甙元、脂肪酸等；③乙酸乙酯部分：亲脂性单糖甙、酚性物、极性大的甙元等；④正丁醇部分：大多数甙类、水溶性生物碱等；⑤水部分糖、氨基酸、可水解鞣质等。三、追踪分离天然活性化合物时需要注意的几个问题21.活性测试方法选择的正确与否是活性追踪分离能否取得成功的关键。最好的方法是寻找活性部位时用整体动物试验，追踪分离成分选用体外的方法。理想的体外活性测试方法应具有简易、快速、不需特殊设备、方便、抗干扰性强、假阳性和假阴性均较低、临床相关性强等优点。2.确保供试材料具有活性：为了确保活性成分的分离工作在可靠的基础上进行，对供试天然药物或中药有时须采用多项指标、体内外结合进行测试加以确认。表2植物粗提取物抗肿瘤活性的筛选方案（美，NCI）植物粗提取↓体外多项指标筛选抗肿瘤活性示有抗肿瘤活性↓体内筛选抗肿瘤活性↓（P-388荷瘤小鼠）↓↓↓无抗肿瘤活性有抗肿瘤活性←←←←←←←←←←↓溶剂分配确定抗肿瘤活性或↓色谱分离作用机制有无新颖性浓缩物↓体外筛选抗肿瘤活性示有新颖性↓示有抗肿瘤活性↓体外复筛抗肿瘤活性↓↓追踪分离活性成分←←有活性无活性（弃去）上述方法有许多优点：①不至于丢失活性低或含量少的化合物；②增加了分离出新化合物的机会；③有可能分离到具有不同作用机理或新的作用机理的化合物。在正式开始活性追踪分离之前，最好要一次性采集或购买到所需的实验材料，并经简易的方法再次确认活性和一次性提取完毕，将提取物置于冰箱中保存。3.在从多生物活性中力求找出最本质的作用：天然药物及中药在临床上往往具有多方面的治疗作用，在动物实验上具有多方面的活性，在体外实验中具有多个作用靶点。研究者应当从这些杂乱的实验现象中找出其中最本质的作用，选择建立能反映临床治疗特点且效果与之平行的活性测试体系才有可能追踪分离出有开发价值的活性成分及先导化合物。表3反应了这方面工作的一些典型实例。表3：供试材料生理作用生理活性测定方法目的活性物质乌头(Aconitumspp.)强心、利尿兴奋、镇痛Yagi-Hartung法（离体蛙心）去甲基乌药碱(higenamine)(大黄Rheumcoreanum及R.palmatum的杂交种）健胃、缓泻致泻活性（小鼠）番泻苷(sennoside)3茵陈蒿(Artemisiacapillaris)贝(Babyloniajaponica)（日本产）利胆、抗炎口渴、视力减退、瞳孔散大、言语障碍胆汁分泌促进作用atropine定量法(小鼠散瞳率试验)茵陈原色酮(capillarisin)等surugatoxin软紫草(Arnebiaeuchroma)止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2合成抑制活性Arnebinol,arnibinonearnebifuranone四、在分离过程中要按“等剂量不等强度原则”对每一阶段所得组分进行活性定量评估并与母体进行比较，追踪分离活性最强的馏分。1.如与母体比较所得几个组分活性强弱参差不齐，则说明活性分离与物质分离平行，预示可能获得良好的分离效果；2.如果某个组分活性显著增强，则说明在分离过程中可能除去了某种具有拮抗作用的物质；3.如果所得各组分活性均明显减弱，即使将其合并，其活性与母体相比也大大减弱，则提示活性成分可能发生分解、破坏或产生了不可逆吸附；4.如果所得各组分分别测试其活性虽然明显降低，但将其合并后其活性与母体相当，则提示是活性成分被分散或该药中的成分存在明显的协同作用(相加或相乘)，故分离后反而导致活性的减弱或消失。5.注意传统汤剂的特点：传统天然药物及中药多为汤剂，从某种意义上来讲，只有溶于汤剂中的成分即水溶性成分才是有效成分。但脂溶性成分是否就一定不是有效成分?实际上未必，其原因有三：(1)在煎煮过程中有些本不溶于水的脂溶性成分会因互溶而溶于汤剂中；(2)古人会用增大剂量的方法提高脂溶性成分的用量，从而达到防病治病的目的；(3)受科技发展的限制，古人没有意识到的并不是不存在的，所以脂溶性成分也可能是天然药物及中药的有效成分。4寻找天然药物有效部位的基本方法一、天然药物活性成分研究的途径实地调查、文献调查↓原植物鉴定和处理↓成分预实验↓提取分离↓活性筛选↓↓有效部位有效成分↓分离,活性筛选↓有效成分↓↓↓↓结构修饰←←←←结构鉴定和测定→→→→药理、毒理研究↓↓↓→→→→→→→→临床实验←←←←按一类新药的研究途径↓新药二、天然药物有效部位或化学成分的分离(溶剂极性依次递增分离法)1．将天然药物干燥样品置于连续回流提取器中，依次用石油醚、乙醚(或氯仿)、醋酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇(或甲醇)、水回流提取，将其按极性由小至大分成七个部分，各部分分别回收溶剂后用蒸馏水或者低浓度的药理试验允许的有机溶剂(如乙醇、丙二醇)稀释、调正体积，作成水溶液或混悬液，灌封于安瓿中供药理筛选用。这七个部分所含化学成分大体如下：①油脂、蜡、叶绿素、萜类、甙元等脂溶性成分；②生物碱、甙元、酚性物、内酯等；5③亲脂性甙类(单糖甙)、酚性成分等；④多数甙类、有机酸等；⑤氨基酸、鞣质、部分单糖类、水溶性生物碱等；⑥糖类、氨基酸、小分子肽类；⑦蛋白质、多糖、多肽、粘液质等。2．将天然药物先用水煎煮，滤液浓缩成1：1或1：2体积后，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分成氯仿液、乙酸乙酯液。正丁醇液和水溶液四部分，回收溶剂，并挥尽溶剂后调正体积，灌封供药理筛选用。这种提取分离方法特别适用于经典传统方剂中药物有效部位的筛选；因为古典方剂大多数都是汤剂有效，这样既方便且易寻找到有效部位。3．★将天然药物粉碎，置连续回流提取器中，用70％～95％的乙醇回流提取，然后回收乙醇、加水至1：1体积，再分别用石油醚、氯仿(或乙醚)、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分取有机层。得五个部分，所得五个部分大体的成分为:①石油醚部分：油脂、叶绿素、亲脂性甙元、甾醇等；②氯仿部分：生物碱、多数甙元、脂肪酸等；③乙酸乙酯部分：亲脂性单糖甙、酚性物、6极性大的甙元等；④正丁醇部分：大多数甙类、水溶性生物碱等；⑤水部分糖、氨基酸、可水解鞣质等。三、追踪分离天然活性化合物时需要注意的几个问题1.活性测试方法选择的正确与否是活性追踪分离能否取得成功的关键。最好的方法是寻找活性部位时用整体动物试验，追踪分离成分选用体外的方法。理想的体外活性测试方法应具有简易、快速、不需特殊设备、方便、抗干扰性强、假阳性和假阴性均较低、临床相关性强等优点。2.确保供试材料具有活性：为了确保活性成分的分离工作在可靠的基础上进行，对供试天然药物或中药有时须采用多项指标、体内外结合进行测试加以确认。表2植物粗提取物抗肿瘤活性的筛选方案（美，NCI）植物粗提取↓体外多项指标筛选抗肿瘤活性示有抗肿瘤活性↓体内筛选抗肿瘤活性↓（P-388荷瘤小鼠）↓↓↓无抗肿瘤活性有抗肿瘤活性←←←←←←←←←←↓溶剂分配确定抗肿瘤活性或↓色谱分离7作用机制有无新颖性浓缩物↓体外筛选抗肿瘤活性示有新颖性↓示有抗肿瘤活性↓体外复筛抗肿瘤活性↓↓追踪分离活性成分←←有活性无活性（弃去）上述方法有许多优点：①不至于丢失活性低或含量少的化合物；②增加了分离出新化合物的机会；③有可能分离到具有不同作用机理或新的作用机理的化合物。在正式开始活性追踪分离之前，最好要一次性采集或购买到所需的实验材料，并经简易的方法再次确认活性和一次性提取完毕，将提取物置于冰箱中保存。3.在从多生物活性中力求找出最本质的作用：天然药物及中药在临床上往往具有多方面的治疗作用，在动物实验上具有多方面的活性，在体外实验中具有多个作用靶点。研究者应当从这些杂乱的实验现象中找出其中最本质的作用，选择建立能反映临床治疗特点且效果与之平行的活性测试体系才有可能追踪分离出有开发价值的活性成分及先导化合物。表3反应了这方面工作的一些典型实例。表3：供试材料生理作用生理活性测定方法目的活性物质乌头(Aconitumspp.)强心、利尿Yagi-Hartung法去甲基乌药碱(higenamine)8兴奋、镇痛（离体蛙心）(大黄Rheumcoreanum及R.palmatum的杂交种）健胃、缓泻致泻活性（小鼠）番泻苷(sennoside)茵陈蒿(Artemisiacapillaris)贝(Babyloniajaponica)（日本产）利胆、抗炎口渴、视力减退、瞳孔散大、言语障碍胆汁分泌促进作用atropine定量法(小鼠散瞳率试验)茵陈原色酮(capillarisin)等surugatoxin软紫草(Arnebiaeuchroma)止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2合成抑制活性Arnebinol,arnibinonearnebifuranone四、在分离过程中要按“等剂量不等强度原则”对每一阶段所得组分进行活性定量评估并与母体进行比较，追踪分离活性最强的馏分。6.如与母体比较所得几个组分活性强弱参差不齐，则说明活性分离与物质分离平行，预示可能获得良好的分离效果；7.如果某个组分活性显著增强，则说明在分离过程中可能除去了某种具有拮抗作用的物质；8.如果所得各组分活性均明显减弱，即使将其合并，其活性与母体相比也大大减弱，则提示活性成分可能发生分解、破坏或产生了不可逆吸附；9.如果所得各组分分别测试其活性虽然明显降低，但将其合并后其活性与母体相当，则提示是活性成分被分散或该药中的成分存在明显的协同作用(相加或相乘)，故分离后反而导致活性的减9弱或消失。10.注意传统汤剂的特点：传统天然药物及中药多为汤剂，从某种意义上来讲，只有溶于汤剂中的成分即水溶性成分才是有效成分。但脂溶性成分是否就一定不是有效成分?实际上未必，其原因有三：(1)在煎煮过程中有些本不溶于水的脂溶性成分会因互溶而溶于汤剂中；(2)古人会用增大剂量的方法提高脂溶性成分的用量，从而达到防病治病的目的；(3)受科技发展的限制，古人没有意识到的并不是不存在的，所以脂溶性成分也可能是天然药物及中药的有效成分。