甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案

甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案(试行)本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4℃（冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。1、基于real-timeRT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-timeRT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本,因此，用此real-timeRT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-timeRT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。三、病毒分离鉴定可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全（一）实验室级别及个人防护1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。（二）健康监测1、所有人员均应自测发热及其他症状。2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。五、附表和附件附表1疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单附表2疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单附件3：real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）附件4：real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）附件5：RT-PCR方法检测甲型流感病毒附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法附表1疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#种类标本量（g或ml）采集日期备注※选项：参照传染病报告卡。#选项：A鼻咽拭子、B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）采集人员：采集单位（盖章）：附表2疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#种类标本量*（g或ml）采集日期备注※选项：参照传染病报告卡#选项：A鼻咽拭子、B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。填表人员：送样时间：单位（盖章）：附件3real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程中文翻译版（请同时参考英文原版）请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。一、概述（一）前提本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。（二）实验原理实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。（三）使用条件一步法定量RT-PCR96孔板热循环系统。（四）生物安全要求样本处理应在相应的生物安全实验室完成。（五）样本要求1、呼吸道样本支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。2、排除标准1）未在2－4°C(≤4天)或-70°C及以下保存的样本2）以上未列的其它不当样本（六）核酸提取RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp®病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒(QIAGEN公司)，罗氏MagNAPureCompactRNA分离试剂盒,MagNAPureLCRNA分离试剂盒II,和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。二、实验材料（一）试剂1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；2、分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)；3、正反向引物(40μM)；4、双重标记探针(10μM)；5、阳性对照。（二）供给1、实验室标记笔；2、微量离心管格栅，96孔0.2mlPCR反应管；3、20μl和200μl可调节移液器及滤芯枪头；4、0.2mlPCR反应管盘；5、光学反应盖板；6、无菌,无核酸酶的1.5ml微量离心管；7、一次性无粉手套。（三）仪器设备1.微量离心机；2.漩涡振荡器；3.实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。三、操作程序（一）准备工作1.避免样品污染由于fluorogenic5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：1）实验准备与核酸提取使用独立区域；2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。2、仪器准备工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNaseAWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。3、试剂准备注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。1）引物和探针（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；（2）涡旋振荡引物和探针；（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。2）RealtimeRT-PCR的试剂（1）将MasterMix和酶置于冰架上；（2）融化2×的ReactionMix；（3）颠倒混合2×的ReactionMix；（4）瞬时离心2×的ReactionMix和酶，置于冰架上。4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA,swFluA,SwineH1(swH1)和RNaseP(RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。5、建立反应反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。3）MasterMix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：*体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；7）每一个mastermix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：实验建立举例：实验样本举例：注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验mastermix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。9）吸取5μl的nucleasefreewater到NTC孔，将NTC孔盖上。10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；12）将提取的核酸样本置于冰架上；13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；16）对剩下的样本，重复步骤13-15；17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。6、RT-PCR扩增条件反应体系为25ul，反应条件如下：注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。*具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。7、解释说明/检验1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNaseP基因扩