第十六章 色谱分离法

Chapter16色层分离法Chromatography概述色谱分离中的概念及其分类色层分离法介绍（8种方法）总结16.1概述16.1.1色谱法的起源1．创立：1906年，俄国植物学家Tsweet植物色素分离见图示2．现状：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析，还可以进行制备固定相——除了固体，还可以是液体流动相——液体或气体色谱柱——各种材质和尺寸被分离组分——不再仅局限于有色物质碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）1906年，Tsweet发现色谱分离现象色谱柱色带16.1.1色谱法的起源植物色素分离图示16.1.2色谱法的发展1、历史30年代茨维特分离绿叶色素，产生固液吸附色谱40年代液—液分配色谱法、TLC、纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代推出了色谱－质谱联用技术（GC-MS）70年代HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大80年代出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法90年代崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微微填充柱色谱法的优点21世纪色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代的重要作用16.1.3色谱法的用途用途：色谱法已广泛用于各个领域，是多组分混合物首选的分离分析方法。以《中国药典》2005版为例，一部收载中药1146个品种，用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有1523项，用高效液相色谱进行定量分析的有479种518项，用气相色谱进行检测的有47种。二部收载的有1967个品种，采用高效液相色谱法的品种有848种。现在色谱法已形成一门专门的科学。第二节色谱分离中的概念及其分类16.2.1概念色谱分离法又称层析分离法：即是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小，分子的极性，吸附力，分子的亲和力，分子的分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相是固定的，称固定相；另一相是流动的，称流动相。当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离。16.2.2色层分离法分类1）．按两相分子的聚集状态分类流动相固定相类型液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱超临界流体色谱法——流动相为超临界流体2）．按固定相的固定方式分类3）．按分离机制分类平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱吸附色层分离法离子交换色层分离法凝胶过滤色层分离法疏水作用色层分离法亲和色层分离法16.2.2色层分离法分类16.2.3展望⑴新型固定相和检测器手性固定相、浸透限制性固定相、灌注色谱固定相、生物色谱固定相等；蒸发光散射检测器⑵色谱新方法的研究超临界流体色谱法、毛细管电泳法、毛细管电色谱法⑶色谱联用技术GC-MS/MS、LC-MS/MS⑷色谱专家系统是一种色谱－计算机联用技术16.2.4色谱系统的基本组成酶活性酶试剂分析法洗脱分析法:洗脱剂对固定相没有亲和力前流分析法：吸附最弱的组分最先流出来顶替分析法：利用一种吸附力比各吸附组分都强的物质来洗脱16.2.5色谱分离的有关术语①分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和流动相中的浓度cqKd②阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的迁移速度和一个理想标准物质的迁移速度之比。其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小溶质的移动距离同一时间内溶剂的移动距离Rf==溶质的移动速度流动相在层析系统中的移动速度msdfVVKR/1116.2.5色谱分离的有关术语③溶出体积色谱柱中，使溶质的最大浓度区从柱中流出时已流出流动相体积，Vs：色谱柱中固定相的体积；Vm：色谱柱中流动相的体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异sdmeVKVVR16.2.5色谱分离的有关术语保留时间（tR）和溶出体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。死体积16.2.5色谱分离的有关术语Martin和Syng最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长度称为理论塔板高度H。经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。④色谱柱的理论塔板数、塔板高度16.2.5色谱分离的有关术语理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：L---柱长22/1)(54.5WtNR2)(16bRWtNNLH16.2.5色谱分离的有关术语第三节色层分离法介绍主要包括16.3.1吸附色谱法16.3.2疏水作用色层分离法16.3.3金属螯合层析16.3.4共价作用色层分离法16.3.5色层分离法16.3.6离子交换层析16.3.7色层分离法16.3.8亲和层析16.3.1吸附色谱法原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离。利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱进行分离的方法，称之为吸附层析。Adsorptionchromatography当溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固定表面上，这就发生了吸附作用。常用的吸附剂：①无机吸附剂:磷酸钙、二氧化钛、氢氧化锌、氧化钙凝胶、膨润土、氧化铝、硅胶、活性炭、硅藻土②有机吸附剂:纤维素、聚酰胺16.3.1吸附色谱法16.3.2疏水作用色层分离法(HydrophobicInteractionChromatography）Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity.1）疏水作用色层分离法：利用固定相载体（琼脂糖）上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。方法：在层析剂（多孔亲水性）基质与起吸附作用的功能团之间接上一段直链碳链（称接枝手臂），能显著提高分离效果。原因：接枝手臂的直碳链本身与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用（疏水效应），增强了对蛋白质的吸附能力和分辨能力。16.3.2疏水作用色层分离法MechanismofHIC用碳链长度依次变化的同系列的烷基琼脂糖SephCn(n=1-6)分别装柱，在相同条下将混合蛋白质溶液通入柱中，不同蛋白质将在烷基琼脂系列柱中显示不同吸附特性，蛋白质的分辨能力取决于碳链的长度，因此可利用系列柱实验来调节己知蛋白质的吸附强弱，然后用缓冲液进行洗脱。3).应用：互换酶的分离蛋白质亚基与蛋白质聚合物的分离多肽与蛋白碎片的分离完整细胞进行选择性吸附2）.操作过程16.3.2疏水作用色层分离法生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合，高离子强度可加强疏水性。跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析步骤的桥梁无须有机溶剂洗脱，保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质4).疏水作用色层特点16.3.2疏水作用色层分离法疏水介质选择16.3.3金属螯合层析(MetalChelatingChromatography)金属螯合层析：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸，组氨酸、咪唑及其类似物发生螯合作用进行分离的方法。金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁16.3.3金属螯合层析利用IMAC分离纯化生物大分子生物分子配基基质结果氨基酸Pt++聚丙烯酰胺MetTryTyrHis=Phe牛血清蛋白Pt++聚丙烯酰胺收率60%溶菌酶Cu++微孔玻璃中空纤维12.2μg/mlCu、Zn-SODCu++琼脂糖收率63%,纯化60倍α2-巨球蛋白Zn++琼脂糖收率60%,纯化34倍α1-抗胰蛋白酶Zn++琼脂糖收率22%,纯化29倍γ-干扰素Zn++琼脂糖收率91.4%人血小板生长因子Cu++、、Zn++琼脂糖重组蛋白Cu++、Co++、Zn++、Ni++共聚物收率10.2μg/ml合成多肽Cu++、Ni++硅-琼脂糖16.3.3金属螯合层析和传统的亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析具有以下优点：(1)配基稳定性高，不易脱落；(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低；(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附；(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑，EDTA，便可将吸附蛋白解吸下来。16.3.3金属螯合层析16.3.4共价作用色层分离法(Covalentchromatography)利用溶质分子与层析剂凝胶之间的共价吸附作用将目的产物与其他溶质分离的一种层析方法。原理：利用二硫键（-S-S-)和（-SH)基相互作用谷胱甘型二硫键层析剂巯基丙基型二硫键层析剂分离过程：吸附：洗脱：再生：应用：分离半胱氨酸、分离含半胱氨酸（-SH)的肽段、分离含-SH基的蛋白质或进一步分离该蛋白质中-SH基附近的肽段。巯基化合物16.3.5聚焦色层分离法(Focusingchromatography)基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱层析法。当向层析柱内通入与柱内初始pH值不同的多缓冲剂时，柱内pH值缓慢改变，在轴向形成连续的pH梯度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸附或者脱附逐次向下移动，彼此之间得到分离。利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。16.3.6离子交换层析(ionexchangechromatography)16.3.7排阻层析（凝胶层析）Gelchromatography凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。16.3.7.1凝胶过滤色层分离法凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。16.3.7.2原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出。16.3.7.2凝胶层析的原理凝胶装置图色谱峰和分离结果16.3.7.3凝胶（一）凝胶的种类和性质1）交联葡聚糖凝胶（Sepha