CRISPR-Cas9基因敲除载体构建试剂盒说明书V1.1

     CRISPR Cas9基因敲除试剂盒 产品说明书    本说明书适用于以下产品：  货号货号CRISPR/Cas9试剂盒 CR0001 CRISPR/Cas9Nick试剂盒 CR0002 pCas9/gRNA1载体 CR1001 pCas9/gRNA3载体 CR1004 pTYNE验证载体 CR1011    V2.0        北京英茂盛业生物科技有限公司       北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916       Tel：010‐62495135       Emai：[e-mail]       Web site：                                                                                        产品说明书 1 北京英茂盛业生物科技有限公司  Tel: 010‐62495135 Email: [e-mail] 产品内容 Cas9基因敲除试剂盒 货号CR0001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐P阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐N阴性对照载体 3ug in TE Buffer Cas9Nicknase基因敲除试剂盒 货号CR0002 内容 包装 pCas9/gRNA3载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pf阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pr阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA1 载体 货号CR1001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA3 载体 货号CR1004 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 货号CR1011 内容 包装 pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer  保存条件： ‐20℃冻存     所需其他材料 ¾EcoRV 限制性内切酶。T4 DNA ligase。 ¾dH5a、Top10或其他常用感受态细胞。 ¾细胞培养基及其他细胞培养相关试剂。 ¾HEK293T细胞或293V细胞（货号C1201）。 ¾转染试剂（Polyfect‐V货号P2010‐1）。                                                                                         产品说明书 2 北京英茂盛业生物科技有限公司  Tel: 010‐62495135 Email: [e-mail] CRISPR Cas9基因敲除原理 CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。一旦与crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA结合形成复合物，Cas蛋白中的核酸酶即可对与复合物结合的DNA进行切割。切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。 1、Cas9蛋白 来自Streptococcus pyogenes 的Cas9由于PAM识别序列仅为2个碱基（GG），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别RNA（gRNA）可以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞，对特异DNA序列剪切，从而促使DNA发生NHEJ ( nonhomologous end‐joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除。 Cas9对DNA切割示意图：  2、Cas9Nicknase蛋白 Cas9Nicknase是Cas9蛋白的D10A突变体，切割DNA单链。由于DNA上的Nick缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase需要成对的gRNA辅助才能实现DNA双链断裂。 采用Nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对gRNA的设计要求较高。敲除效率也比Cas9蛋白低一些。 简单地说，Cas9基因敲除效率更高，操作更容易；Cas9Nicknase特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。 Cas9Nicknase对DNA切割示意图：          北京英茂盛业 010‐62495Email: order@i用pCas9   pCas9/g挑选            业生物科技有限n.com 135 inovogen.com 9/gRNA1gRNA载体转染目的选转染阳性            限公司 或pCas9 构构在pTY体与筛选载的细胞性细胞，检果            9/gRNA3设计基因构建pCas9构建pTYNYNE载体载体共检测敲除效            3 3载体进行因敲除靶点9/gRNA载NE验证载体上进行靶效pCa            行基因敲除点载体载体靶点验证as9/gRNA转染挑选转染            除流程 A载体与重染目的细胞染阳性细胞果        产品重组载体共胞胞，检测敲果本试剂盒中包含内容品说明书 共敲除效                                                                                      产品说明书 4 北京英茂盛业生物科技有限公司  Tel: 010‐62495135 Email: [e-mail] 操作说明 CRISPR/Cas9基因敲除载体构建 引物列表： 引物名称 序列（5’‐3’） 用途 gRNA‐F GACTATCATATGCTTACCGTAACT pCas9/gRNA1、pCas9/gRNA3载体鉴定和测序 gRNA‐R CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA pCas9/gRNA1、pCas9/gRNA3载体鉴定  所需试剂： EcoRV核酸内切酶； T4 DNA连接酶； dH5a、Top10或其他常用感受态细胞； DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒。  pCas9/gRNA1载体 pCas9/gRNA1载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化Cas9蛋白和gRNA，只需转染一个质粒就能实现对靶基因的切割。                                                                                        产品说明书 5 北京英茂盛业生物科技有限公司  Tel: 010‐62495135 Email: [e-mail] pCas9/gRNA3载体 pCas9/gRNA3载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化Cas9Nickase蛋白和gRNA。  载体原件说明： CMV promoter：昀广泛使用的真核细胞启动子之一，在绝大多数哺乳动物细胞中高效表达。 Cas9/Cas9Nick：人源化的Cas9蛋白或Cas9Nicknase蛋白，实现DNA切割功能。 BGH pA：BGH polyA信号。 U6 promoter： U6启动子属于III类RNA启动子，有精确地转录起始位点和终止位点，可以准确的转录出gRNA，并且在各种动物细胞中都表达良好。 gRNA：识别基因敲除靶点。   简要步骤 1、设计合成寡核苷酸链。 2、将寡核苷酸链退火为双链。 3、EcoRV酶切线性化 pCas9/gRNA1载体。 4、寡核酸链与pCas9/gRNA1载体连接并转化感受态细胞。 5、PCR鉴定阳性克隆并测序。 注： 对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等步骤，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。                                                                                        产品说明书 6 北京英茂盛业生物科技有限公司  Tel: 010‐62495135 Email: [e-mail] 1 基因敲除靶点和寡核苷酸设计 1.1基因靶点选择 CRISPR/Cas9基因敲除系统的靶点由19个碱基构成。靶点前面为转录起始信号G。靶点后面为PAM序列NGG。在设计基因敲除时，在基因的起始密码子附近及下游查找GN20GG序列作为靶点。如果没有合适的序列，也可以选择N20GG的序列，构建载体时人工加上一个G作为启动信号。 推荐使用Zhang Lab的在线设计软件进行设计：。 以人的MET基因(GeneID: 4233)为例，可选的靶点如下：            Start Codon     靶点1 ATAAACCTCTCATAATGAAGGCCCCCGCTGTGCTTGCACCTGGCATCCTCGTGCTCCTGTTTACCTTGGTGCAGAGGAGC靶点2 AATGGGGAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCGGAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTTAAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGC靶点挑选要点： 1）：Cas9/gRNA基因敲除原理是对基因组DNA序列切割后引发DAN修复，产生DNA序列缺失突变。因此基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。 2）：现有的研究显示不同Cas9/gRNA靶点在基因敲除效率上有较大差异，但对其原因尚不清楚。因此同时设计构建2‐3个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点是必要的。 3）：现在的研究表明靠近PAM的碱基对靶点的特异性很重要，前7‐12个碱基的错配对Cas9切割效率影响较小。而碱基错配的影响在不同靶序列中差别很大，有的靶序列特异性较高而有的较差。将设计好的靶点序列在基因库中进行BLAST检测是必要的。同时多设计构建2‐3个靶点并且在检测敲除效率的同时检测非特异性切割也有助于获得理想的基因敲除效果。 4）Cas9Nicknase需要挑选成对的靶点。我们一般在正义链和反义链上分别挑选相距20‐30bp的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。  1.2  插入片段设计 干扰靶点序列通过EcoRV位点插入pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3载体中。 插入完成后完整的gRNA表达框序列如下： U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCT