选修三 1.1重组技术基本工具

蓝色素基因三色紫罗兰玫瑰导入目的基因受体细胞专题1基因工程§1.1DNA重组技术的基本工具基因工程概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性基因工程培育抗虫棉的主要步骤：步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”步骤三：抗虫基因进入棉花细胞解决培育抗虫棉的步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体一、DNA重组技术的基本工具一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”•⒈主要来源：•⒉种类与命名：•⒊作用特点：•⒋作用结果：一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1.主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成Goon⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢT磷酸二酯键1234512345A（一）限制性核酸内切酶分子手术刀ATGGCATCTTCGAA磷酸二酯键：即脱氧核糖、磷酸之间的连接（一）限制性核酸内切酶分子手术刀EcoRI限制酶的切割黏性末端黏性末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaI限制酶的切割平末端平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。•想一想限制酶所识别的序列有什么特点？•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制性内切酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成要实现目的基因与载体的连接则在对其切割时应选用同一种限制酶。可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？•常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别提供的物品：剪刀（代表EcoRⅠ、HindⅢ）透明胶带（代表DNA连接酶）环状质粒一种含有目的基因的DNA片段大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端.HindⅢ能识别AAGCTT序列，并在A和A之间切割形成黏性末端.要求：找出质粒和目的基因的相应的切割位点，待切割位点全部切开后，将目的基因导入重组到质粒中。课堂练习１.以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：（1）---CTGCA（2）---AC（3）GC---（4）---G---G---TGCG------CTTAA（5）G---（6）---GC（7）GT---（8）AATTC---ACGTC------CGCA---G---你能用ＤＮＡ连接酶将它们连接起来吗？（）和（）能连接成：（）和（）能连接成：（）和（）能连接成：（）和（）能连接成：２７４８３６１５ＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＣＡＣＧＴＴＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧ２.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶A课堂练习３.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA课堂练习D课堂练习４.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒下课了!