第二章-菌种选育

第二章菌种选育、保藏与复壮为什么选育菌种？菌种的重要性？菌种的选育方法——自然选育人工诱变杂交育种原生质体融合基因工程构建为什么要菌种保藏？为什么要复壮？重点、难点：重点内容：菌种的选育方法;菌种选育的理论基础;人工诱变、杂交育种、原生质体融合的原理和操作方法;营养缺陷型的筛选、检出、鉴定。第一节菌种选育菌种选育：由于自然的或通过人工的方法使微生物发生变异，再通过识别、分离、筛选得到具有更优良性状的高产菌株的过程。一、微生物菌种选育的理论基础基础知识微生物学、遗传学、生物化学（一）微生物的遗传和变异遗传：变异：微生物的遗传和变异的特点：（1）微生物繁殖快，生活周期短，变异了的个体可以迅速表现出来；（2）微生物由于个体小，其比表面积大，易于引起细胞变异；（3）微生物大多以无性繁殖或以无性繁殖为主，而且营养体多数为单倍体，便于建立纯系。微生物的变异包含稳定性变异和不稳定性变异稳定性变异：不能回复到变异发生前的状态；不稳定性变异：当环境恢复到正常状况时，其形态和特性又能恢复原状，是暂时的。（二）遗传和变异的物质基础1、研究历史1866年，Mendel的试验——豌豆杂交试验1910年，Morgan的果蝇试验——确认遗传因子—基因1897年，Miescher发现核酸，但没有认识到其重要意义。微生物遗传学的三个经典实验——细菌转化实验草花叶病毒的拆和实验噬菌体感染实验遗传的物质基础------核酸(DNA,RNA)2、遗传物质的分子结构和化学组成（1）遗传物质的化学组成核酸核苷酸（2）遗传物质分子结构DNA的双螺旋结构。碱基互补，对应。（3）DNA的复制半保留复制。单细胞细菌只具有一个DNA分子，细胞分裂一次，DNA就复制一次。3、遗传物质在细胞中的存在形式真核生物，遗传物质在染色体上。原核生物，拟核，DNA分子呈裸露状态。质粒，基因与染色体，二、自然选育自然选育：它是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。自然选育是发酵生产中经常性工作。为什么？由于自发突变的正突变率很低，多数菌种产生负变异，其结果是使生产水平不断下降。因此，在生产中需要经常进行自然选育工作．以维持正常生产的稳定．选育高产菌种不是自然选育的主要目的。（一）菌种退化变异的原因1、遗传基因型的分离遗传基因型的分离？有何表现？2、自发变异的产生3、人工诱变导致的退化变异（二）自然选育的目的和适应条件目的：保持菌种优良性状的稳定性；保持菌种的纯度；将具有高产性状的微生物从混杂的群体中分离出来，建立高产菌株占优势的群体。适应条件（什么情况下进行自然选育）：长期保存时，使菌种尽可能纯化；菌种选育时，及时自然分离，得到稳定的高产菌株。（三）自然选育的方法自然选育步骤：1．通过表现形态来淘汰不良菌株2．通过目的代谢物产量的考察3．进行遗传基因型纯度试验，以考察菌种的纯度4．传代的稳定性试验具体方法与操作？（试剂药品、仪器设备、操作方法）可以干活了！基本齐了！三、诱变育种诱变育种：是指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。20世纪40年代开始诱变育种，获得青霉素高产变异菌株。目前仍是一种比较经济、高效的育种方法。因为：一是对生物调控机制还了解不够透彻；二是基因工程的方法耗费大。（一）突变突变：从生物表型上说是突然发生的可遗传的变化，这种变化就称为突变。带有这种变化的菌株称为突变菌株。突变包括基因突变（点突变或微小损伤）和染色体畸变两大类。自然突变或自发突变：在自然状况下发生的突变。诱发突变：在人为地用物理或化学因素诱发的突变。（二）诱变的基本原理诱变剂：用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因索，又称诱变剂。三类：物理、化学、生物诱变剂。2、诱变剂作用机理诱变剂作用机理各不相同，诱变效果也不同。（1）物理诱变剂快中子、60Co、γ-射线、β-射线----电离辐射。引起染色体倒位、易位、缺损、重组及其他畸变。紫外线-----不形成离子的非电离辐射(最常用)。紫外线对生物诱变最有效的波长是------200~300nm，其中260nm左右作用最大。胸腺嘧啶(T)二聚体的形成是紫外线引起细胞突变的主要原因,改变了正常的配对，破坏了腺嘌呤(A)的正常掺入作用。复制就会在这一点上突然停止或错误地进行。图2—3，图2—4。光复活作用：紫外线照射后造成的DNA损伤在可见光下可以被修复。直接光复活：通过光激活酶而发生的，该酶可以使胸腺嘧啶二聚体解开而重新成为单体。黑暗复活或间接光复活：不需要光照，细胞在黑暗中减慢了大分子的合成速度，有利于某些细菌能够产生恢复紫外线损伤的DNA的酶，该酶的产生不用可见光，它包含特殊的核酸酶，把含有胸腺嘧啶二聚体的DNA链形成单链，切断二聚体，修复、复制而形成新的DNA的双螺旋。（2）化学诱变剂作用机理3类：A.烷化剂类亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲等。当鸟嘌呤N—7位烷化后，由于分子重量加大，使其与核糖的结合链容易发生水解作用而脱落(图2—5)，从而形成缺口．在生物体自行修复过程中易产生错误，引起碱基对排列顺序的改变而产生基因突变。图2—5烷化鸟嘌呤的脱落B.结构类似物如5—溴尿嘧啶、5—氨基尿嘧啶、8—氮鸟嘌呤、2－氨基嘌呤和6—氯嘌呤等。通过代谢作用才能掺入到DNA分子中去，所以对于代谢作用基本上停止的细胞则不起作用，对于离体DNA以及游离的噬菌体颗粒也不起作用。C.移码诱变剂如吖啶类物质和ICR类化合物。由于这类化合物的插人，造成DNA链上碱基的添加或缺失，这样在DNA复制时突变点以下的碱基对发生错误，引起所有遗传密码的转录和翻译错误而造成突变。主要是指噬菌体，可用作抗噬菌体菌种的选育，其作用原理可能与传递遗传信息、诱发抗性突变有关。(3)生物诱变剂（三）诱变处理的基本方法（诱变育种的基本程序）1、诱变剂的选择2、诱变剂量的选择3、增效（变）剂4、出发菌株的选择5、考虑影响诱变效果的因素6、诱变方法7、诱变效应的测定8、优良突变菌株的筛选1、诱变剂的选择可以选一种,（物理的或化学的）也可以二者复合使用紫外线主要作用在DNA分子中的嘧啶上；亚硝酸则主要作用于DNA分子的嘌呤上；复合使用可使突变谱变宽，效果比单一因素好。但用复合因子诱变后，由于突变的性状多而广，而且有些突变呈隐性状态．在传代过程中易分离，不能符合纯种的要求，因此一次复合因子处理后需经多次分离纯化才能获得性状稳定的变异株。2、诱变剂量的选择一般以致死率选择采用的剂量。例如，UV处理，致死率为90%~99.9%，现在，有的采用低的剂量，70~80%，甚至30~70%。一般认为，如果菌株不很稳定，要求稳定地提高其发酵单位．宜用缓和的因子和低剂量为好。如果出发菌株比较稳定，又要求突变幅度大，则可考虑用较强的诱变剂和诱变剂量。3、增效（变）剂有一些因素本身并不是诱变剂，但它们与诱变剂配合使用起到协同作用，可提高诱变率。如氯化锂与UV、乙烯亚胺等物理或化学因子复合处理，得到土霉素高产的菌株，氯化锂使用量为0.5％左右，可以加在平板中，也可在菌处理前用氯化理进行前处理，使其先进入细胞，然后用紫外线照射。4、出发菌株的选择现使用的生产菌种做出发菌株（最常用）；获得的突变株对生产工艺条件比较容易适应，缺点是这类菌株的遗传性能均较为稳定，不易得到突变株，有时需要多次或多种诱变因素处理，才能得到预期的结果。自然界中分离的野生菌株做出发菌株一般在特定环境中筛选，如发酵厂区，葡萄园，腐朽的草木等等。5、考虑影响诱变效果的因素外部环境条件如温度、氧气、pH、水分等都能影响诱变效果。如使用化学诱变剂时，pH影响很大，用X射线照射大肠杆菌时发现温度对其突变率是在18℃和24℃时最高。出发菌株的生理状态也影响诱变效率。处于生长状态(处于转录或转译状态)的菌株对诱变剂最为敏感。真菌和放线菌大部分可以产生孢子，为单细胞．诱变处理主要是用孢子。芽孢细菌也可以用芽孢进行诱变处理。尽量使用幼年孢子,制成孢子悬液。6、诱变方法物理诱变（紫外线照射为例）化学诱变常用的化学诱变剂及诱变方法：物理诱变（紫外线照射为例）菌悬液的制备：单细胞悬液106个／ml•照射处理：照射剂量：采用15W30cm这样条件时，使微生物致死率为90％－99．9％所需的照射时间因微生物种类不同而异。一般微生物营养体约3—5min,芽孢10min即可。•突变株的选择：形态鉴别及发酵性能测定。•化学诱变a．处理真菌孢子药物浓度为0.025mol/L，取孢子悬液2ml，加入1ml0.1mol/LNaNO2溶液和1mlpH4．5醋酸缓冲液，27℃保温处理若干分钟(如l0min)后，取出2ml加到10m10.07mol/LpH8．6的磷酸氢二钠缓冲液中，pH下降至6.8左右以中止诱变。然后稀释涂平板；培养后挑取单菌落进行选择。b．处理细菌处理药物浓度为0.05mol/L，其处理方法是将出发菌株接入5m1肉汤中．于37℃振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，加入数毫升无菌生理盐水，洗涤一次，离心后菌体悬浮在2.5ml0.1mol/L醋酸缓冲液中(PH4.5)，然后加入2.5ml0.1mol/L亚硝酸钠，在37℃处理数分钟(如5min左右)后稀释涂皿，培养后挑取单菌落，选择突变株。7、诱变效应的测定直接法将诱变处理过的细胞接种到琼脂培养基上，以获得单菌落，然后检测其发生变异的情况。（主要观察菌落形态的变化）产抗菌素的放线菌的菌落特征霉菌的菌落特征酵母菌的菌落特征浓缩法常用青霉素浓缩法（营养缺陷型菌株的分离）直接测定菌株的生产性能发酵实验测定目的代谢物的产量等。8、优良突变菌株的筛选半理性化筛选琼脂柱预筛选法(以抗生素筛选为例)•随机筛选直接摇瓶筛选法四、微生物的杂交育种以基因突变为理论基础进行的菌种选育-----自然选育和诱变育种以基因重组为理论基础进行的菌种选育-----杂交育种、原生质体融合、基因工程目的：把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至改变菌种特性，获得新的品种。•杂交育种的程序1．菌种准备原始亲本和直接亲本菌株；遗传标记：营养缺陷型。2．杂交育种使用的培养基先了解：完全培养基(CM)，基本培养基(MM)，有限培养基(LM)，补充培养基(SM)。3．杂交育种的方法(1)细菌杂交(2)放线菌的杂交育种(3)霉菌的杂交育种(1)营养缺陷型的筛选通过诱变处理后，由于发生突变的菌株比例较小．必须通过选择性培养，以淘汰未突变的“野生型”菌株，。常用的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等。青霉素法：利用青霉素抑制细胞壁合成的原理。在含有青霉素的基本培养基中，野生型细菌细胞中的蛋白质等细胞物质仍在继续合成，而细胞壁却不再增大，细菌因此而破裂死亡。随后把培养物转入不含青霉素的完全培养基(CM)中，营养缺陷型的细菌开始生长。（青霉素浓缩法）。注意事项：菌丝过滤法：其原理是霉菌等的分生孢子可以在基本培养基中长成菌丝体，而缺陷型孢子则不生长。将诱变处理过的孢子在基本培养液中培养．然后过滤去掉菌丝，留下缺陷型孢子。。差别杀菌法：其原理是利用芽孢比营养体耐热，用高温杀死野生型的营养体时保留缺陷型的芽孢。将处理过的芽孢培养在基本培养基中，经过一定时问，加热至80℃以上，将生长的野生型菌杀死而留下缺陷型芽孢。(2)营养缺陷型的检出有限量补给法、逐个测定法、夹层培养法、影印培养法等，比较经典和最常用的是影印法。影印法：黎德伯格等(LederbergJ.和LederbergE.M.,1952)设计。夹层培养法(又称延迟补给法)先在灭菌培养皿中倒上一层基本培养基，待冷凝以后加上一层含菌的基本培养基，冷凝以后再加上一层不含菌的基本培养基，在适温下培养出现菌落，在皿底作上标记。然后加一层完全培养基，进行适温培养，在完全培养基上出现的新菌落，大多数可判定为营养缺陷型。(3)