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1第三章生物样品与样品制备药学院药物分析教研室2【大纲要求】1、掌握生物样品的种类及其特点2、掌握生物样品的各种预处理方法的原理及其应用3第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存4一、种类、采集和制备(一)血液(Wholeblood,Plasma,Serum)1、血样采集2、血样制备血浆的制备血液→含有抗凝剂的试管→混合→2500r/min~3000r/min离心5min→上清液即为血浆。血清的制备血样→室温放置30min到1h→出现血饼→剥去血饼→以2000r/min~3000r/min离心5min~10min→分取上清液即为血清不能作为作用部位药物浓度的可靠指标当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时,使用血清样品5肝素的加入:1ml血液/需要肝素0.1~0.2mg,通常不需准确加入,在取血前可取少量肝素钠溶液(1~2滴)置于试管内,旋转试管,使肝素溶液均匀分布于试管壁上,干燥后加入血样后立即轻轻振摇即可。6全血:血液置于抗凝管中,不经离心操作,冷冻储存或直接分析需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制血浆药物浓度很低凝影响测定血样的特点:缺点:损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦优点:可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药物监测大多数测定的时原型药物总量7(二)尿液1、尿药测定用途:药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型2、尿的采集:非损伤性采样方式、药物浓度较高、收集量较大、收集方便,易受食物、饮水等影响。3、尿样的保存与处理:8(三)唾液1、唾液的采集:漱口后15min进行,采集时间为10min,采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌;(1)缩短采样时间,(2)减小唾液pH变化范围,(3)刺激后得到的唾液其唾液-血浆分布比例的个体差异较小。2、唾液的保存与处理:取样后,除去泡沫,分层后离心,取上清液冻存或直接分析。3、优点:(1)非损伤性取样,(2)可用于药代动力学研究,(3)不受采血时间和地点限制,(4)样品易收集,病人易接受4、应用:(1)在TDM中的应用根据S/P分类,S/P<1.0表示药物在唾液中的浓度很低;S/P=1.0表示适合药物的监测;S/P不固定表示药物显著转移到了唾液中;S/P很大表示药物的离子化程度很低(2)药代动力学参数的测定9组织(1)匀浆化法:组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液(2)沉淀蛋白法:组织→加入蛋白沉淀剂→上清液(3)水解:组织→加入酸或碱→加热使组织液化→上清液(4)酶水解:组织→加入酶和缓冲液→加热使组织液化→上清液10头发优点:取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的检测缺点:样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低、需要精密仪器11特点:广谱性积累性稳定性依时性相关性指纹性一般在枕部采取样本,国外一般在靠近头皮处剪取,分别于6~10处取10个样本,从根部剪断,超过12cm的均按照12cm处剪断12头发洗涤1、丙酮-水-丙酮2、丙酮预洗→洗洁精洗涤3、洗衣粉浸泡4、二氯甲烷5、SDS洗涤6、甲醇头发的预洗都需要反复清洗2~3次13毛发样品的制备1、直接甲醇提取2、酸水解3、碱水解4、酶水解5、超临界流体萃取6、有机破坏14二、生物样品的贮存与处理(一)冷藏或冷冻1、血浆和血清:采血后及时分离(2h),短期4℃,长期-20℃2、尿样:应立即测定,否则需加防腐剂置冰箱保存3、唾液:在4℃下保存,往往需要在取样时测定pH值4、生物样品总的原则:临时解冻,解冻的样品一次测完,不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC);样品应以小体积分装存放。15第二节生物样品的预处理与制备16一、预处理目的(一)药物从缀合物中释放,测定总浓度(二)纯化、富集药物(三)适应和满足测定方法要求的灵敏度(四)防止对分析仪器的污染和劣化17二、样品制备时应考虑的问题(一)药物的理化性质、存在形式和浓度范围(二)药物测定的目的(三)生物样品种类和杂质干扰类型(四)样品的化学组成(五)药物的蛋白结合率(六)被测组分在预处理过程中的稳定性(七)样品在收集、储存等过程中容器的污染(八)样品的预处理过程要求简便(九)预处理的最后一步应富集被测组分(十)对分析方法的要求1819三、样品的预处理技术(一)经有机破坏的方法1、湿法破坏2、干法破坏硝酸-高氯酸法高温电阻炉灰化法电热消化器法低温等离子灰化法电热板消化法烘箱消化法3、氧瓶燃烧法20(二)去除蛋白质1、溶剂解法常用溶剂(与水相混溶的有机溶剂):乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃体积比:1:1~390%去除方法:超速离心(10000r/min)2122(二)去除蛋白质2、加入中性盐常用中性盐(置换蛋白结合的水,使蛋白脱水而沉淀):饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐比例:1:290%去除方法:超速离心(10000r/min)23(二)去除蛋白质3、加入强酸常用溶剂(与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀):10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液、5%偏磷酸体积比:1:0.690%去除方法:超速离心(10000r/min)2425其他去除蛋白的一些方法1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂2、超滤法3、酶水解法4、加热法26(三)分离、纯化与浓集1、液-液提取法(LLE)2、固相萃取(SPE)3、自动化SPE技术4、固相微萃取(SPME)5、膜萃取(ME)6、微透析技术(MD)7、超临界流体萃取(SFE)271、液-液提取法(LLE)大多数药物都是脂溶性的,内源性物质基本上都是水溶性的,当用有机溶剂萃取时,药物被萃取出来而内源性物质被除去,因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的。28关键要考虑三个方面的因素:(1)有机溶剂的特性(2)有机溶剂相和水相的体积(3)水相的pH值29选择溶剂应注意的问题:(1)了解药物与溶剂的化学结构及性质,根据相似相溶来选择(2)要求对分子型药物易溶,离子型药物不溶(3)沸点低、易挥发和浓缩(4)要与水不相溶(5)无毒、不易燃(6)不易乳化(7)具有较高的化学稳定性和惰性(8)不影响检测溶剂的选择与纯度要求302、有机相和水相的体积:一般为1:1~1:23、水相的pH值:碱性药物→pHpKa+1~2酸性药物→pH<pKa+1~24、提取次数:往往进行的是一次萃取,个别情况下可以对分离出的含药有机相用一定的pH水进行反萃取(Backextraction)31优点:选择性;药物能与多数内源性物质分离缺点:乳化、有毒、不环保、不自动,对极性大的化合物的萃取效率低总的流程图:血浆或其他生物样品加入萃取溶剂分取有机层必要时调pH值减压氮气吹干流动相溶解后进样分析32消除LLE中产生的乳化现象:1、提取前在水相中加入适量的固体食盐2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层,再融化后离心来消除已产生的严重乳化现象33LLE的两种特殊萃取方法:离子对提取法(Ion-pairextraction)提取烷基法(Extractivealkylation)离子对提取法:是一种用有机溶剂提取离子型药物的方法。原理:一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离子状态,成为强亲水性的带电荷离子,不易被提取出来。当加入与药物呈相反电荷的反离子物质时,即可成为具有一定脂溶性的离子对,用有机溶剂可萃取出来。34碱性药物:庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等酸性药物:四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵提取溶剂:氯仿、二氯甲烷352、固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)(1)原理根据液相萃取的原理,利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后,一些小分子药物被吸附,经适当洗涤除去杂质,再用少量溶剂洗脱,可达到分离、纯化目的。决定因素:药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力36洗脱方式:(1)药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力-先被保留后解吸(2)药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力-直接洗脱37可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少、节省实验费用和时间38(2)SPE固相选择的原则-固定相与被测组分应具有相似的极性,含有被测组分的样品应使用极性相反的溶剂溶解后上柱,而用与被测组分相似极性的溶剂洗脱Ⅰ→亲脂性键合相硅胶(C18、反相硅胶)Ⅱ→大孔吸附树脂(苯乙烯与二乙烯苯共聚物)Ⅲ→离子交换树脂Ⅳ→亲水型填料(硅藻土、正向硅胶)3940(3)SPE方法建立-以亲脂性键合硅胶为例1、以甲醇润湿小柱,活化填料,甲醇含量8%2、用水或缓冲液冲洗小柱,洗去多余的甲醇3、上样,弃去废液4、用水或缓冲液冲洗小柱除去水溶性杂质5、用合适的洗脱剂洗脱小柱,收集洗脱物6、回收溶剂后进行分析和监测41实验中的注意事项1、体液样品可直接上柱,上样体积在0.1~2.0ml2、洗脱流速在1~2ml/min3、萃取介质中含有少量的甲醇可以提高萃取率4、萃取碱性药物时,常需在洗脱机中加酸、有机胺、醋酸铵或离子对试剂5、选用苯基和氰基柱时,需用极性溶剂如丙酮洗脱6、选用反相硅胶柱时,少量的甲醇和乙腈即可完成洗脱42Ⅱ:大孔吸附树脂特点:具有较大的比表面积、吸附容量大、可反复使用、价格便宜、最常用的是非极性、一般用乙醇-水或甲醇-水即可解吸待测物质、加入适量的无机盐有助于吸附预处理:用乙醇浸泡除去杂质(或用酸碱泡),并使其充分溶涨,在用水洗去有机溶剂后使用。注意事项:树脂要保持湿润43Ⅲ:离子交换树脂1、对弱酸性药物→在中性或碱性条件下用阴离子交换法萃取→用水或甲醇清洗→酸性溶液洗脱2、对碱性药物→在中性或酸性条件下用阳离子交换法萃取→用水或甲醇清洗→碱性溶液洗脱离子交换树脂适用于高极性和可电离性药物的纯化44Ⅳ:亲水性填料原理:分配作用,水基质样品分布于填料表面为固定相,流动相为与水不相混溶的有机溶剂,较为亲脂的药物从固定相转移到流动相就完成了萃取,与LLE雷同。操作:上样到亲水性固定相表面→用与水不相混溶的有机溶剂洗脱目标化合物→强亲水的蛋白质等保留在固定相上。注意事项:1、硅胶填料→先用甲醇和水处理后上样2、硅藻土/棉纤维→直接上样,不需清洗并可再生3、样品萃取无浓集作用,萃取体积大,样品较干净45萃取方法的选择1、亲脂性药物→LLE、反相硅胶、大孔吸附树脂、亲水性填料2、碱性药物(亲脂性)→大孔吸附树脂3、亲水性强可离解的药物→离子交换树脂4、亲水性强不可离解的药物→沉淀蛋白后进样46(4)各萃取方法之间的比较SPE方法间的比较47SPE方法的优点:1、引入的杂质少2、可以完全避免乳化的形成3、有较高的萃取回收率,重现性好4、小柱可弃,没有污染5、需要的样品量少6、洗脱溶剂多为水溶性的,易于实现自动化48SPE的缺点:1、价格昂贵2、技术要求高3、小柱各批之间有差异4、主子容易堵塞,影响分离效果49SPE与LLE即沉淀蛋白的比较1、SPE萃取时间短,可自动化2、LLE萃取达平衡的时间较长3、二者在萃取回收率即选择性等方面,因药物与萃取条件而变,不好比较4、沉淀蛋白法简便、快速、回收率高,但不适合于含量低的样品5、三种方法得到的都是药物的总量3、自动化SPE技术50自动化SPE技术的优点和缺点(1)节约时间(2)平行操作带来了高的工作效率(3)减少了操作误差,提高准确度和精确度(4)安全性好优点缺点(1)残留物对测定有干扰(2)要考虑样品的物理或化学性质的稳定性对样品测定的影响51自动化设备在线技术(On-linetechnique)独立柱工作站(Discretecolumnworkstation)96通道工作站(96-wellstations)52在线提取技术(1)限制性介质填料(RestrictedaccessmediaRAM)(2)湍流色谱(Turbulentflowchromatography(3)在线固相萃取技术53限制性介质填料:是一种直接进样预处理技术,通过控制硅胶微粒孔径的大小及表面结构来分离
本文标题:体内药物分析-----第三章--生物样品与样品制备
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