实验一、培养基制备与消毒灭菌

实验一、培养基制备与消毒灭菌实验目的及要求了解培养基配制原理，学习并掌握培养基制备方法。了解消毒与灭菌应用范围及基本原理，学习并掌握实验室常用消毒与灭菌方法。学习一些微生物的实验准备工作。实验原理培养基的制备培养基：满足微生物生长的营养需要，人工配制的混合营养基质。用途：用于微生物的分离、培养、增殖、保藏及鉴定。牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生细菌的培养）马铃薯糖培养基（常用于培养真菌）高氏一号培养基（用于培养放线菌）配制原则根据营养不同配制不同培养基注意各种营养物质的浓度及配比调节适宜的pH值考虑加生长因子培养基应物美价廉灭菌处理培养基1根据化学组成分类完全用天然物质或其浸出汁配制。成分不确定。如肉汁、豆芽汁、牛乳、土豆汁是天然营养原料。酸奶、饮料酒、腐乳、酱类的发酵生产。优点：配制方便，成本较低，营养丰富。生产上用缺点：成分不确定。（1）天然培养基：培养基培养基分类：（2）合成培养基全由化学成分已知的物质配制的培养基。成分确定。如：高氏培养基、察氏培养基。优点：成分确定，重复性强，宜于科学研究如菌种选育，遗传分析。实验室用。缺点：费用较高。培养基（3）半合成培养基由部分天然物质和一些成份已知的化学药品配制而成。如：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。优点：营养成分更全面、均衡。实验室、发酵业用得最多。培养基2根据物理状态分类（1）固体培养基概念：在液体培养基中加入凝固剂——琼脂、明胶、硅胶等。常用的是琼脂（洋菜）。琼脂加入量1.5～2.0％。▼成分为多缩半乳糖▼绝大多数微生物不能利用▼融化温度96℃，凝固温度45℃▼对微生物无毒性固体培养基作用培养菌落进行分离、鉴定、计数、保藏琼脂的特性：培养基（2）半固体培养基（3）液体培养基加入凝固剂。琼脂加入量0.2～0.5%作用：观察细菌的运动状况。不加凝固剂用于发酵业。液体培养。培养基消毒与灭菌消毒：应用理化方法杀灭部分微生物（主要是病原微生物）。灭菌：应用理化方法杀灭物体上所有微生物。类型一、加热高温灭菌1.干热灭菌▲火焰烧灼灭菌▲热空气灭菌2.湿热灭菌▲常压蒸汽灭菌▲高压蒸汽灭菌▲煮沸法灭菌▲超高温灭菌二、紫外线灭菌三、过滤灭菌四、化学药剂的消毒与灭菌消毒与灭菌一.高温灭菌：利用高温使菌体蛋白和核酸变性而失去活力以达到杀菌的目的。二.紫外线灭菌：诱发菌体核酸结构变异，及使空气中氧电离、水氧化而产生杀菌化学物质以杀灭杂菌。三.过滤除菌：将处理的含菌液体或气体通过细菌过滤器，使杂菌被机械截留从而达到除菌。四.化学药剂的消毒和灭菌：杀菌剂（破坏微生物的代谢机能并有致死作用）；消毒剂；防腐剂（抑制微生物的生长繁殖）。消毒与灭菌利用温度的灭菌方法高温灭菌：蛋白质凝固变性，酶失活。高温灭菌干热灭菌湿热灭菌火焰灭菌烘箱内干燥热空气灭菌巴斯德消毒法间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法消毒与灭菌1干热灭菌(dryheatsterilization)1）火焰灭菌：接种时的用具如接种环等无经济价值的物体。特点：彻底、迅速。2）干燥热空气箱灭菌用法：160-170℃,2小时（利用热空气灭菌)特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。消毒与灭菌2湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌)1）巴斯德消毒法(pasteurization)a方法：63~66℃----30min或71℃---15min或135℃or150℃---2secb特点：不破坏营养物质，并杀死病原菌。c适用：牛奶、饮料等食品生产。消毒与灭菌2）间歇灭菌法a方法：28~37℃24h培养37℃24h培养100℃/15－30min100℃/15－30min100℃/15－30min用水蒸汽把培养基加热到100℃，分几次蒸煮以达到彻底灭菌又保护营养成分的目的。b适用：营养含量高、不适于用高压蒸汽灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。此法麻烦、周期长。消毒与灭菌2湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌)3）高压蒸汽灭菌法:利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，提高温度以达到高温灭菌目的方法。a方法：一般121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）20min-30min。b适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。c注意事项：▲灭菌开始排净冷空气；▲灭菌终了，缓慢降压；▲灭菌结束，趁热取出物品。消毒与灭菌2湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌)干热灭菌的操作包扎。装箱（物品不可与灭菌箱内壁接触，且不可摆放过挤）灭菌（启动开关，并打开排气孔，待温度升至80℃-100℃关闭排气孔，继续升温至160℃-170℃计时，恒温2小时）降温，取物（关闭电源，自然降温到60度开箱取物）消毒与灭菌消毒与灭菌高压蒸汽灭菌的操作灭菌前准备（在锅内加适量水）。装放物品（不要过挤，且容器口端不要与物品接触）加热放气（打开放气阀，待有大量水汽排出，维持3—5分钟，锅内空气排尽，关上放气阀）升温保压（温度，压力升至灭菌所需时计时，压力1.05Kg/cm2,121.3℃，20—30分钟）出锅（关闭电源，待指针回零，打开放气阀，稍等一些时间，再取物）消毒与灭菌消毒与灭菌★湿热灭菌较干热灭菌效果好1)特点：温度低、时间短、灭菌效果好。2)灭菌效果好的原因：菌体内含水量越高凝固温度越低。蒸汽冷凝会放出潜热。饱和水蒸汽穿透力强。消毒与灭菌实验内容分组操作：分8组，7~8人1组。每组需要做的工作。（1）1、2、3、4、5组做牛肉膏蛋白胨培养基。每组做600ml。装试管10支，余下装三角瓶。（2）6、7、8组做马铃薯糖培养基。每组200ml。装试管10管，余下装三角瓶。（3）每组包1ml吸管8-9支。（示范）（4）每组包10ml吸管3支（5）每组装9ml无菌水10管。（示范）（6）每组包培养皿2包（每包6个）（示范）（7）装锅灭菌。1牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生细菌的培养）（1）培养基组成：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂18--20g水1000mlPH7.0----7.2（2）配置方法①称量：②溶化：电炉加热熔化③调节PH：④分装：试管和三角瓶⑤包扎：双层纸和绳子。⑥灭菌：高压蒸汽灭菌。实验内容（2）配制方法：①称量：注意马铃薯去皮后切成丝称量。②溶化：将马铃薯丝放入水中置于电炉上加热并不断搅拌，煮沸5—10min，用多层纱布过滤得滤液，在滤液中加入其他药品，不断搅拌直至完全溶解。③分装：④包扎：⑤灭菌：2马铃薯糖培养基（通常用于培养真菌）（1）培养基组成：马铃薯200g葡萄糖或蔗糖20g琼脂18---20g水1000mlPH自然实验内容3、高压蒸汽灭菌（1）灭菌前的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加入适量的水，将内桶放入。（2）装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。（3）加热排气：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，维持3-5min，锅内空气排尽，关上排气阀。（4）升温保压：★压力为1.05kg/cm2（121.3℃）,20-30min（5）出锅：隔断热源，自然降温，待压力表指针回到零，打开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。实验内容实验报告（1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？（2）为什么培养基配制好后必须立即灭菌？（3）在培养基中，琼脂有何作用？它有哪些特性？（4）使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时应注意哪些事项？（5）比较干热灭菌与高压蒸汽灭菌的异同。自主设计性实验（学生综合实验技能训练）自主设计性实验（每5个学生1组）结合已做过的实验，每组选择一个自己感兴趣的综合设计性实验选题，从实验的设计、准备、实验操作、实验结果的分析到最后实验报告的完成都由学生自己动手完成，教师对设计报告的科学性、可行性把关、指导，并指导学生实验。参考选题：1、嗜盐菌的分离及初步鉴定2、产淀粉酶菌株的分离及初步鉴定3、葡萄皮上菌种分离及葡萄酒发酵4、常见水果滋生真菌分离及初步鉴定5、常见蔬菜腐烂滋生细菌分离及初步鉴定6、实验室环境和人体表面微生物的检查7、米酒的酿造8、平菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测9、香菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测