植物总RNA的提取及RT-PCR

1植物总RNA的提取及RT-PCR一、实验目的1.学习从植物组织中提取总RNA的方法2.了解RT-PCR的基本原理和实验方法二、实验原理1.RNA提取的原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。2.RT-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。三、仪器、药品与试剂配方(一)仪器及器皿1．低温离心机；2．琼脂糖凝胶电泳系统；3．高压灭菌锅；4.PCR仪；5．研钵；6.一次性手套等；7.离心管；8.培养皿；9.烧杯及试剂瓶等。(二)药品1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.异硫氰酸胍(GT)3.醋酸钠(NaAc)4.苯酚5.异丙醇6.氯仿7.乙醇8.β－巯基乙醇9.琼脂糖10.MLV反转录试剂盒11.TaqDNA聚合酶12.引物(三)试剂配制1．0.1%DEPC水灭菌2.4mol/L异硫氰酸胍3.2mol/LNaAc（pH4.8）灭菌4.3mol/LNaAc（pH4.8）灭菌5.4mol/LLiCl灭菌6.1×TE缓冲液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）,灭菌。四、实验步骤（一）总RNA的提取（1）研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2g植物材料，充分研磨后转入一个含有300l的4MGT的1.5ml的聚丙烯管中，摇匀。（2）加入30l2MNaAc（pH4.9-5.2）摇匀，加入300l酸酚（水饱和酚pH5.0），2摇匀，加入100l三氯甲烷，摇匀。（3）12000rpm4℃离心20min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15min。（4）12000rpm4℃离心10min，将沉淀悬浮于含100l4M氯化锂的1.5mlEP管中，于-20℃放置1小时或更长时间。（5）12000rpm4℃离心10-15min，将沉淀溶于0.4mlDEPC水中，加入1/2体积氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000rpm4℃离心5min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000rpm4℃离心5min。（6）上清液加入1/10体积的3M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或更长时间。（7）12000rpm4℃离心15min，超净台吹干，沉淀溶于10lb灭菌的DEPC水中。（8）RNA贮于-80℃。（二）RNA反转录产生cDNA在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入：模板RNA2µlOlig(dT)181µlDEPC水2µl混匀，70℃水浴中放置2min，立即放置到冰上2min。然后在冰上依次加入：RNasin0.5µlM－MLV5×buffer10mMdNTP1µl2µl1.5µl42℃，水浴中反应90min。72℃，10min，终止反应。加入15µl的DEPC灭菌水，使总体积达到25µl。(三)PCR1.在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系10Xbuffer2.5µldNTP(2.5mmol)2µlRT-PCR产物5µlTaq酶0.5µl上游引物（10µmol/l）0.5µl下游引物（10µmol/l）0.5µl灭菌ddH2O加到25µl2.按照下列条件进行PCR反应94℃5min94℃30s55℃30s72℃1min30个循环72℃7min4℃（四）电泳检测将加EB的1%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×TE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm。将RNA及DNA样品加到凝胶点样孔中，85V条件下电泳30min，在紫3外灯下观察结果。五、注意事项1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。3.使用DEPC时，应在通风橱中戴手套操作。4．RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）电泳槽：去污剂洗干净，水冲洗，3%H2O，0.1%DEPC水彻底冲洗。4）用烘烤过的药勺称取试剂。5）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。6）含有Tris一类的缓冲液，不可用DEPC处理。