分光光度法(金)

分光光度法和722分光光度计的使用沈阳医学院生物化学教研室TheDepart.ofBiochemistryShenyangMedicalInstitute1.分光光度法的概念利用物质所特有的吸收光谱对物质进行鉴别和定量测定的方法叫做~。2.原理1)分光光度法的核心原理——比色分析法待测物+呈色剂有色溶液以溶液呈色的深浅判断其浓度2)分光光度法的核心定律——Lambert-Beer定律当单色光透过某种有色溶液时,溶液的光密度(OD)与溶液的厚度和浓度成正比.OD=KLCOD光密度值（OpticDensity)K消光系数(为常数)L溶液厚度C溶液浓度有色溶液I0IaI反射光分散光其他因素损失光则，I0=Ia+I+反射光分散光++其他因素损失光干扰因素空白管不含待测样品，且具备其他一切光学因素经空白管校正后：I0=Ia+I则，透光率T=II0经空白管校正后，我们可以认为，透光率T的变化完全取决于待测样品含量的多少。Lambert定律：当单色光透过某种有色溶液时，透过光强度随液层厚度增加而指数地减弱。I=I0×10-KL则，透光率T=II0=I0×10-KLI0=10-KL则，光密度D=-㏒T=-㏒10-KLKL=Beer定律：当单色光透过某种有色溶液时，透过光强度随溶液浓度增加而指数地减弱。I=I0×10-KC则，光密度D=KC则，Lambert-Beer定律为：D=KLC3)应用①标准曲线法②标准管法①标准曲线法特点：方便、快捷，适用于大批量样品处理方法：a.标准曲线绘制配制一系列与待测样品溶质相同的，浓度由小到大的标准溶液，分别测OD值。CD0b.未知样品浓度测定CD0DxCx②标准管法特点：相对准确，适用于少量样品处理方法：设标准溶液，浓度已知，分别测样品和标准溶液的OD值。D测=KLC测D标准=KLC标准C测=D测D标准×C标准4)分光光度法的优点灵敏：能测定出溶液中含量极少的物质浓度准确：误差小，与真实值非常接近快速：操作步骤简单，较少时间内得出结果简便：无需从溶液中分离待测样品5)分光光度法所使用的仪器——分光光度计分光光度计的基本结构光源单色器吸收池受光器测量器检测系统分光光度计的分类400~760nm（可见光）200~400nm（紫外光）760~10,000nm（红外光）6)分光光度计的使用方法①接通电源，预热30分钟；②装样；③选择波长；④调零；⑤测定；⑥关闭电源，清洗比色杯。实验一用分光光度法测定血清蛋白含量实验二绘制吸收曲线实验一用分光光度法测定血清蛋白含量【实验目的】1.掌握标准曲线的制备方法和标准管法的计算方法；2.掌握双缩脲法测定血清蛋白的原理和方法。【实验原理】呈色反应茚三酮反应双缩脲反应√尿素被加热至180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。【操作方法】1.标准曲线制备：①取6支试管，标注0~5号，按照下表加入试剂，混匀，静止30分钟；标准酪蛋白溶液蒸馏水(ml)双缩脲试剂(ml)00(ml)2.04.010.41.64.020.81.24.031.20.84.041.60.44.0试剂管号②于540nm波长下测定各管OD值；③以酪蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；2.未知样品浓度测定：取5号管，吸取1ml（1：10稀释）血清待测样,用水补足至2ml，加入双缩脲试剂4ml，混匀后与以上4管同时比色，从标准曲线查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出血清原液浓度。3.标准管法：C测=D测D标×C标C原液=C测×（2+4）×10实验二绘制吸收曲线【实验目的】•掌握绘制吸收曲线的原理和方法【实验原理】各种物质都有其独特的吸收光谱。不同物质对单一色光的吸收程度不同；相同物质对不同波长单色光的吸收程度也不同。如果利用不同波长的单色光透射待测物质溶液时，会得到一系列相应的OD值，那么：lD此光滑曲线即为该种物质的吸收曲线。吸收曲线有何意义？①定性：测定待测物质的吸收曲线，与已知曲线比对，推定该物质是什么，既定性检定；②定量：定量测定已知物质时，可选用该物质的最大吸收峰波长，达到最佳测量效果。【操作方法】①开机预热30分钟；②装样：以蒸馏水为空白，用0.005%KMnO4溶液加入另一比色杯；③调不同波长测定OD值：在500~570nm区间测量，每隔10nm测量一次，其中520~540nm之间每隔5nm测量一次；（注意：每次变动波长需重新调零!）④绘制曲线：以l为横坐标，相应OD值为纵坐标，描记各点，连接成光滑曲线；⑤查找结果：从曲线上查找吸收最强的单色光波长。