微生物培养基

微生物培养基第一节培养基选择和配制的原则第二节工业发酵培养基第三节培养基的灭菌第一节培养基选择和配制的原则培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其他生长所必须的环境条件。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品质量和产量都有重要的影响。所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。一、培养基的类型和用途1.根据来源分：2.根据主要成分或使用目的分：3.根据生产工业的要求分：天然培养基合成培养基半合成培养基基础培养基增殖培养基鉴别培养基选择培养基孢子培养基——供制备孢子用；种子培养基——满足菌种生长；发酵培养基——满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累营养不能太丰富，尤其是有机氮源；无机盐浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色；注意pH和湿度营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等二、培养基类型的选择1.从微生物的特点来选择2.液体和固体培养基选择3.从生产实践和科学试验的不同要求选择4.从经济效益方面考虑选择生产原料三、培养基的配制原则1.根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基2.注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势3.营养成分的恰当配比（C/N一般取100:0.2～2.0）4.渗透压，营养物质要有合适的浓度5.合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入）6.氧化还原电位7.考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀四、培养基成分配比的选择1.参照前人所使用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方2.结合所用菌种和产品的特性3.采用摇瓶、玻璃瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验4.观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响5.综合考虑各因素的影响6.得到一个适合该菌种的培养基配方以得到高产正交试验设计——减少试验次数，确定培养基组分和浓度方差分析——了解哪些因素影响大，以引起注意四、培养基成分配比的选择a)氮源过多，菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；b)氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。a.碳源过多，容易形成较低的pH值；b.碳源不足，菌体衰老和自溶。C/N不当影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物形成。注意速效碳、氮源和缓效碳、氮源的相互配合，选用适当的C/N。一般发酵工业中C/N为100:（0.2～2.0）但对于氨基酸生产，由于产物中含氮较多，因此C/N就要适当调整，如100:（15～21）第二节工业发酵培养基消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率能产生最高的产品或菌体的浓度能以最大的速率产生产物副产品的得率最小价廉并具有稳定的质量来源丰富且供应充足易于通气和搅拌提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，使之尽可能满足下列条件：发酵培养基例子代谢产物衣康酸赤霉素核黄素青霉素培养基甘蔗糖蜜，150g/L；ZnSO4，1.0g/L；MgSO4，3.0g/L；CuSO4，0.01g/L葡萄糖，20g/L；MgSO4，1.0g/L；NH4NO3，1.0g/L；KH2PO4，5.0g/L；FeSO4∙7H2O，0.01g/L；MnSO4∙4H2O，0.01g/L；ZnSO4∙7H20，0.01g/L；CuSO4∙5H2O，0.01g/L；玉米浆（干固形物），7.5g/L大豆油，20mL/L；甘油，20mL/L；葡萄糖，20g/L；玉米浆，12mL/L；酪蛋白，12g/L；KH2PO4，1.0g/L葡萄糖或糖蜜，总量的10％；玉米浆，总量的4％～5％；苯乙酸，总量的0.5％～0.8％；猪油或植物油；消泡剂，总量的0.5％一、工业上常用的碳源碳源来源葡萄糖纯葡萄糖，水解淀粉乳糖纯乳糖，乳清粉淀粉大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等蔗糖甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。甲醇作为底物生产单细胞蛋白（SCP）用烷烃进行有机酸、维生素等的生产碳源供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物。二、工业上常用的氮源无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等有机氮源：玉米浆，豆饼粉，花生饼粉，棉籽粉，鱼粉，酵母浸出液等氮源主要构成菌体细胞物质，作为酶的组成成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH、Eh等。工业上常用的氮源及含氮量（质量分数/%）氮源含氮量氮源含氮量大麦1.5～2.0花生粉8.0甜菜糖蜜1.5～2.0燕麦粉1.5～2.0甘蔗糖蜜1.5～2.0大豆粉8.0玉米浆4.5乳清粉4.5三、无机盐无机盐是微生物活动不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值和Eh等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。1.磷酸盐2.硫酸镁3.钾盐4.微量元素磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO4•3H2O、K3PO4和Na2HPO4•12H2O、NaH2PO4•2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。①除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成；②处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；③不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成①钾离子与细胞渗透压和透性有关；②是许多酶的激活剂；③促进糖代谢①Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；②一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；③特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴四、生长因子从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。提供生长因子的农副产品原料1)玉米浆2)麸皮水解液3)糖蜜4)酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。五、前体物质和促进剂1.前体物质某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。氨基酸发酵的前体物质氨基酸菌体前体物质产量/%丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸1.6色氨酸异常汉逊酵母氨茴酸0.8色氨酸麦角菌吲哚1.3蛋氨酸脱氢极毛杆菌2-羟基4-甲基硫代丁醇1.1异亮氨酸粘质赛杆菌α-氨基丁酸0.8异亮氨酸阿氏棒状杆菌D-苏氨酸1.5苏氨酸谷氨酸小球菌高丝氨酸2.0抗生素发酵常用的前体物质抗生素前体物质抗生素前体物质青霉素G苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如乙基酰胺等金霉素氯化物青霉素O烯丙基－硫基乙酸溴四环素溴化物青霉素V苯氧乙酸红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐放线菌素C3肌氨酸灰黄霉素氯化物链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸2.发酵过程中的促进剂和抑制剂在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵工业生产过程中，可以在发酵培养基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或抑制剂。常用促进剂表面活性剂——洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80、植酸等二乙胺四乙酸大豆油抽提物黄血盐甲醇促进剂能促进产量增加的原因：主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。A.在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。B.抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。抗生素的抑制剂抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥药物不同促进剂所起的作用：i.起生长因素的作用；ii.可推迟菌体的自溶；iii.抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；iv.降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；v.改变发酵液的物理性质，改善通气效果；vi.可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成等。第三节培养基的灭菌在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其它微生物共存，因此所有发酵过程，必须进行纯种培养整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌操作除了设备应严格按规定保证没有死角，没有构成染菌可能的因素外，必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的。在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。只有不受杂菌污染，发酵过程才能正常进行。一、灭菌的方法1.干热灭菌法2.火焰灭菌法3.电磁波、射线灭菌法4.湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）5.化学药剂灭菌法6.过滤除菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对于热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃、1～1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单，灭菌彻底，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。250～270nm之间杀菌效率高，以波长在260nm左右灭菌效率最高。除紫外线外，X射线和γ射线也可进行灭菌。一、灭菌的方法利用饱和蒸汽进行灭菌原理：水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，高压情况下可获得高温的水蒸汽。借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说，温度升高10℃时，灭菌速度常数可增加8～10倍，对营养细胞更高。另外蒸汽冷凝为水时还要释放出潜热，因此温度可进一步提高蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121℃，30min某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。药剂杀菌原理使用浓度高锰酸钾使蛋白质、氨基酸氧化从而使微生物死亡。0.1～3％漂白粉次氯酸钠在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡。1～5%酒精溶液使细胞脱水，引起蛋白质