通过饮奶进行乳糖不耐受人群的筛查及干预对策的研究内蒙古伊利实业集团股份有限公司

通过饮奶进行乳糖不耐受人群的筛查及干预对策的研究内蒙古伊利实业集团股份有限公司2008.9云战友目录研究背景研究目的研究内容–我国乳糖不耐受人群的调查–高水解率低乳糖牛奶的开发–高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验该项研究得到的支持和相关评价研究背景很多人由于小肠上皮细胞乳糖酶缺乏，饮用牛奶后乳糖不能被分解吸收，乳糖进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹胀、肠鸣、肠绞痛直至发生腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐受症。除表现为乳糖不耐症者外，还存在乳糖代谢不良但不表现为症状的人群，本研究中称之为乳糖吸收不良者。乳糖不耐受症与乳糖吸收不良（不表现为症状但乳糖代谢不良）合称为乳糖酶缺乏。研究背景•乳糖酶缺乏在欧洲北部后代中占15%,黑人及拉丁人群占80%,而美国印第安人和亚洲人可高达100%--SwagertyDLJr.,WallingAD,KleinRM.Lactoseintolerance[J].AmFamPhysician,2002,65(9):1855-1856.•6-10岁亚洲儿童的乳糖不耐受85-100%---QuakSH.LactoseintoleranceinAsianchildren.JPaediatrChildHealth1994;30:91–2.•杨月欣教授研究了中国儿童乳糖不耐受症的发生率，结果表明3-5岁、7-8岁、11-13岁组儿童中，乳糖不耐受发生率分别为12.2%、32.2%、和29.0%，乳糖酶缺乏发生率分别为38.5%、87.6%、87.8%--卫生研究，Vol.28,No.1,1999。•肖玉桦等人的调查结果表明我国健康成人的乳糖酶缺乏率高达92%--现代预防医学，Vol.26,No.1,1999;有如此高的比例吗？研究背景•分别给成人受试者50、25、12.5g乳糖，乳糖酶缺乏率分别为100%、86.4%、59.1%---新医学，1988，Vol.19：512；•分别给成人受试者25、12.5、6.25g乳糖，乳糖酶缺乏率分别为85%、48.9%、2%;---中国药学杂志，1998，Vol.33，No.5•分别给受试者（7-18岁）25、12.5、6.25g乳糖，乳糖酶缺乏率分别为79.3%、19.7%、7.2%;---中国学校卫生，2002，Vol.23，No.2乳糖酶缺乏率、不耐受症状发生率受乳糖摄入量的影响研究目的•有必要根据年龄，设计每次摄入牛奶的适宜量，通过饮用适宜量的牛奶，筛查得到乳糖酶缺乏数据和乳糖不耐受数据。这一数据对于生活习惯和健康的关系最大；•在此基础上，研究如何满足乳糖酶缺乏和乳糖不耐受消费者饮用牛奶的需要。研究内容我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验我国乳糖不耐受人群的调查伊利集团联合中科院生物物理所中生金域诊断技术有限公司、哈尔滨医科大学、西安交通大学医学院少儿卫生教研室、中国优生科学协会钙工程专业委员会对北京、哈尔滨、西安三大城市3-70岁的人群通过饮奶，进行乳糖不耐受调查。我国乳糖不耐受人群的调查试验方法：•测试前两天至测试结束前，受试者禁止饮奶及奶制品；•测试前一天至测试结束前，受试者禁食大量水果（一天250克以上）；•测试当天早晨，要求受试者不进食、不饮水，空腹到测试现场参加测试。•将1490名志愿者按年龄段分为6组，每组饮用不同数量的纯牛奶（乳糖含量为4.8%）。受试者一次饮完液态纯牛奶，同时吃完现场配送的面包，饮奶后至测试结束前，不得再饮水、进食，饮奶后1小时排空尿液，饮奶后2小时收集尿液，然后用中生金域诊断技术有限公司的尿半乳糖试剂盒测定被调查人群的乳糖耐受情况。我国乳糖不耐受人群的调查分组情况和饮奶量3-4岁125ml5-6岁250ml7-9岁300ml10-12岁350ml13-17岁400ml≥18岁450ml我国乳糖不耐受人群的调查乳糖耐受能力的评价标准测定结果饮奶后的症状乳糖耐受能力阴性无消化道症状乳糖耐受阳性无消化道症状乳糖吸收不良阳性有腹痛、腹部不适、恶心、腹胀、腹泻一项乳糖不耐受症阳性（乳糖吸收不良、乳糖不耐受症）统称为乳糖酶缺乏我国乳糖不耐受人群的调查年龄（岁）例数正常乳糖酶缺乏例数（发生率）乳糖吸收不良乳糖不耐受症X2P3-417312152（30.0%）45（26.0%）7(4.0%）5－61509060（40.0%）42（28.0%）18(12.0%）0.7747－1022415173（32.6%）58（25.9%）15(6.7%）0.13111－141448460（41.6%）42（29.2%）18(12.5%）2.13815－17793247（59.5%）39（49.4%）8(10.1%）6.495＜0.0118－40399156243（60.9%）174（43.6%）69(17.3%）0.07641－70321107214（66.7%）143（44.5%）71(22.1%）2.3363-701490701749(50.2%)543(36.4%)206(13.8%)不同年龄组牛奶乳糖不耐受的检出情况饮奶状况例数乳糖酶缺乏例数（发生率）乳糖吸收不良乳糖不耐受症经常饮奶573291（50.8%）223（38.9％）68（11.9％）不常饮奶740391（52.8%）270（36.5％）121（16.4％）我国乳糖不耐受人群的调查经常饮奶诱导不了乳糖酶活性，症状可弱化--卫生研究，Vol.28,No.1,1999。乳糖酶为非诱导酶---NewcomerAD,McGillDB.Gastroenterology,1967,53(6):881-889.乳糖酶缺乏受遗传影响？•乳糖酶基因位于2号染色体长臂(2q21)，酶蛋白先是由小肠上皮细胞合成一个220KD的前体物,然后再继续加工剪切成180KD的成熟酶蛋白。多数研究认为：断奶后乳糖酶活性的下降不依赖于膳食中乳糖的存在,多项研究均证明乳糖的摄入并不能维持或增强乳糖酶的活性,因此进食乳糖并不能抑制基因决定的乳糖酶的表达。•芬兰儿童对牛奶过敏与其基因型为C/C-13910相关,其成人型乳糖酶活性低下也与该基因型相关。有研究表明我国北方5个少数民族的乳糖不耐受和该基因在该处的变异关系不大。•还有一种乳糖不耐受也可由腹泻导致。但一般可以在腹泻症治愈后恢复。研究内容我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验高水解率低乳糖牛奶的开发乳糖酶的选择乳糖水解率快速方法的开发低乳糖牛奶生产工艺的确定低乳糖牛奶在货架期内的褐变情况乳糖酶的选择目前仅来源于微生物的β－半乳糖苷酶有工业应用价值，不同微生物来源的β－半乳糖苷酶的性质有所不同。考虑安全性、经济性以及适应性，最终选择来源于乳酸克鲁维酵母产生的β－半乳糖苷酶。乳糖酶的选择图1温度对乳糖水解率的影响01020304050607080202530354045505560反应温度(℃)乳糖水解率(%)随着反应温度的升高，乳糖酶催化乳糖的水解率增加。当达到一定温度时，温度再升高，乳糖酶催化乳糖的水解率就开始降低。从图中可以得到，该酶的最适反应温度为39-41℃。乳糖酶最适反应温度的确定乳糖酶的选择图2pH值对乳糖水解率的影响0102030405060708055.566.577.588.5反应pH值乳糖水解率（%）pH值低于6.5时，酶活力随着pH值的下降迅速降低，pH值在6.5-7.0时活性达到最大值。该酶的最适反应pH值为6.5-7.0，该酶最适pH值恰好在鲜乳的天然pH值之间，因此适合鲜奶的水解。乳糖酶最适反应pH值的确定冰点法低乳糖牛奶产品的水解率是衡量其乳糖水解程度的一项重要的生产指标。用HPLC法测定乳糖需要昂贵的仪器，不便于工厂使用。为了探寻一种适合于低乳糖牛奶生产中检测分析需要的简便快捷的新方法，开发了冰点法，利用冰点降低幅度可以测定牛奶乳糖水解率。得出较准确的冰点公式为X=(ΔΤ+0.5601)/-0.2907方法特点：节省检测时间，节约检测成本。HLPC每测定一个样子，费用在200元。而冰点仪每开一次机进行校正的费用仅为12元，可以测定几十个样品。乳糖水解率快速方法的开发乳糖水解率快速方法的开发葡萄糖氧化酶—分光光度法•牛奶中1分子的乳糖水解成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖，通过测定葡萄糖的量就可以得到已水解的乳糖量。测定原理如下：•β-D葡萄糖+O2+H2OD-葡萄糖酸+H2O2•H2O2+4-AAP+苯酚红色醌化物+H2O•1ml乳糖水解牛奶稀释到10ml，取20μL到葡萄糖酶试剂与苯酚试剂等体积混合液，加好试剂后置37℃恒温水浴反应20min，在505nm波长处测定吸光度值并计算葡萄糖浓度。PODGOD乳糖水解率快速方法的开发将低乳糖牛奶分两份，一份直接测葡萄糖，另一份加入10000NLU/L的乳糖酶置于39℃的环境中反应2小时充分水解牛奶重残余乳糖，然后测定葡萄糖的浓度。乳糖水解率的计算公式乳糖水解率=×100%全水解后葡萄糖的浓度葡萄糖浓度葡萄糖氧化酶—分光光度法乳糖水解率快速方法的开发12345样品吸光度值0.2470.3630.5080.6200.736实际加入量（g/L）1.0181.5042.0212.5073.016试验中测得的量(g/L)0.9881.4252.0322.4802.944回收率(%)97.0596.54100.5498.9297.61葡萄糖氧化酶法准确度试验乳糖水解率快速方法的开发葡萄糖氧化酶法精密度试验123456平均值标准偏差变异系数水解的样品吸光度值0.3340.3390.3440.3510.3460.342———牛奶中水解了的乳糖含量（g/100mL）2.6722.7122.7522.8082.7682.7362.7410.0471.7%完全水解样品吸光度值0.6180.6510.6470.6450.6540.654———牛奶中乳糖完全水解的含量即牛奶水解前乳糖的含量(g/100mL)4.9445.2085.1765.1605.2325.2325.1590.1092.1%乳糖水解率（%）53.13低乳糖牛奶生产工艺的确定流程1：原料奶杀菌冷却到最适温度加酶搅拌水解UHT冷却包装低乳糖牛奶生产工艺的确定图3最适温度乳糖水解率随时间的变化0102030405060708090100012345678时间（h）水解率（%）2000NLU/L1500NLU/L1000NLU/L随着反应时间的延长，添加不同浓度乳糖酶的牛奶的水解率在增加，当水解率超过80%以上，乳糖的水解率趋于平缓。乳糖水解率达到70%就可以解决乳糖不耐受的症状，综合考虑，在最适反应温度下水解牛奶中乳糖的最佳工艺条件是酶的添加量为1500NLU/L，水解时间2小时。最适温度（39℃）下乳糖水解率随时间的变化低乳糖牛奶生产工艺的确定流程2：原料奶巴氏杀菌（85℃，15S）冷却到（4℃）加酶搅拌水解UHT冷却包装低乳糖牛奶生产工艺的确定图44℃乳糖水解率随时间的变化0102030405060708090100020406080100120140160时间（h）水解率（%）2000NLU/L1500NLU/L1000NLU/L经过12小时，添加2000NLU/L乳糖酶的巴氏杀菌牛奶的水解率达到70%以上。在低温下水解牛奶中的乳糖的最佳工艺条件为添加2000NLU/L的乳糖酶放置一个班次的时间。低温下乳糖水解率随时间的变化低乳糖牛奶生产工艺的确定流程3：原料乳杀菌(UHT)冷却到15℃灌装包装水解无菌添加乳糖酶无菌乳糖酶的制备采用膜过滤技术进行原料除菌，使产品在无菌添加时不会受到二次污染。采用膜过滤可以使酶活力损失降低至最小，最大限度地保持酶制剂活力，同时能保证乳糖酶的颜色呈现透明色。首先将乳糖酶通过无菌膜除去杂质和微生物，加工成无菌包装的乳糖酶，然后通过无菌在线添加设备将无菌袋包装的乳糖酶直接添加