自杀基因治疗法-肿瘤克星分析

尽管肿瘤治疗技术在不断提高和改进,但每年因患肿瘤而逝世的病人仍在不断增多。传统的肿瘤治疗方法,如外科切除、放射治疗和化学药物治疗并不能完全地治愈肿瘤,这就需要引入一种新的安全有效的肿瘤治疗技术。对肿瘤分子水平上的研究已经证实，所有肿瘤都伴随有基因突变的存在，都是继基因型变化后发生表型的变化。由此，人们推断肿瘤的发生发展都与基因的变化有关联．因而在生物疗法中基因治疗是最具潜力的。至20世纪80年代后期,随着生物学的发展,基因疗法开始应用于肿瘤治疗。•基因疗法：利用健康基因填补或替代基因疾病中某些缺失或病变的基因。•目前做法是先从患者体内获取部分细胞，以对人体无害的逆转录病毒为载体，把正常的基因克隆到病毒上，然后再用这些病毒去感染人体细胞，通过它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体细胞“获得”正常的基因，以取代原有的异常基因。现在常用的基因治疗技术主要通过以下几种策略来完成对肿瘤的治疗：(1)基因替换和基因补充，转换突变的癌基因或补充肿瘤细胞中缺失的抑癌基因；(2)基因导入以增强免疫效应细胞的抗癌效能；如：导入细胞因子基因或免疫共刺激分子基因以增强免疫效应细胞的杀癌能力；(3)基因导入以增强肿瘤细胞的免疫原性，如：导入MHCI类抗原基因；(4)肿瘤药物敏感基因治疗--自杀基因的应用；(5)肿瘤药物耐受基因--治疗造血功能的保护；(6)反意治疗技术：根据碱基互补原理，人工合成特定DNA或RNA片段（或其他化学修饰产物）抑制或封闭癌基因表达；(7)诱导分化治疗：在分化诱导剂的作有用下促进肿瘤细胞分化以达到治疗癌症的目的。药物敏感基因---自杀基因治疗日益受国内外肿瘤研究者的关注.•自杀基因治疗（suicidegene），是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死。这类基因称为自杀基因，又称药物敏感性基因。•目前在基因治疗中常用的自杀基因系统有大肠杆菌胞嘧碇脱氨酶基因（EC-CD），TK-GCV系统、CD-5-FC系统等。自杀基因疗法应用较为广泛，它除了应用于肿瘤，骨髓移植，心血管疾病等的治疗。•自杀基因治疗法治疗肿瘤的基本步骤：（1）寻找具有治疗意义的目的基因；（2）建立行之有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统；（3）目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的；（一）选择有效的外源基因（1）HSV-TK/GCV系统：HSV-TK（单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶）基因：该类基因相对于哺乳动物的TK基因，更易使抗疱疹的核苷类似物磷酸化成为环腺苷-磷酸；作用原理：抗疱疹的核苷类似物环腺苷一磷酸环腺苷三磷酸，通过DNA聚合酶α加入到DNA复制中，导致链反应终止以及DNA链断裂。转导了HSV-TK的肿瘤细胞可被清除。研究表明，只要转导细胞数占肿瘤细胞的10%~70%就可使肿瘤完全被清除。（旁观者效应，磷酸化的核苷可通过细胞间隙从阳性细胞传递到周围细胞以及转导后的肿瘤细胞可以分泌白细胞介素IL-6和IL-1作为旁分泌因子介导细胞的死亡）HSV-TK（磷酸化）激酶（2）CD/5-FC系统：CD（胞嘧啶脱氨酶），在细菌和真菌中表达而在哺乳动物中不表达；无毒性的前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-FU可转化为脱氢核苷酸环腺苷一磷酸(FUTP)，或者直接掺入RNA干扰rRNA和mRNA的功能。此系统也有旁观者基因的存在。5-FU很容易在细胞内和细胞外通过非易化扩散。靠近转导CD后的细胞的其他细胞也被抑制，即使只有2%细胞被转导，肿瘤也能明显被抑制。CD（二）基因导入的载体•有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。目前使用的载体有两大类：转染性载体（利用化学或物理方法增加膜的通透性而将DNA转染入细胞，有脂质体和基因枪）和转导性载体（利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞）。病毒载体介导基因转移，以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒（AV）、腺相关病（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等载体。•导入目的基因的方法：体外法：从患者体内取出细胞，在体外培养并转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输患者体内，让外源基因表达体内法：不需细胞移植而直接将外源DNA注射至体内，使其在体内转录、表达而发挥治疗作用。常用的转移手段有病毒介导、寡核苷酸直接注射、受体介导、脂质体介导和体内基因直接注射等。基因转导的靶向性•带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是治疗的关键，只有提高基因转导的靶向性才能实现治疗的针对性和安全性，目前解决基因的靶向转移及表达有三种策略：（1）利用基因工程手段改造基因载体，使所包装的重组病毒特异性地识别位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇；（2）在体内基因传递系统中共价连接肿瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基，使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面；（3）应用肿瘤细胞特异蛋白管家基因的表面调控元件，在转录水平调控目的基因在靶细胞中的表达。各种组织靶向细胞及其优点：骨髓：容易获得；可体外培养；易返回机体上皮细胞：使用腺病毒可在体内将基因转入呼呼上皮；经内窥镜接近肠上皮进行体细胞基因疗法皮肤：最容易大面积接近的组织；干细胞可使表面持续更新；皮肤中转基因表达可影响全身血管内皮；外源性遗传物质可转入血管组织内皮细胞间皮：间皮覆盖了体腔内表面，由单层细胞组成肌肉：裸露质粒DNA可注射转入骨骼肌或心肌。基因转入骨骼肌后可在体内持续表达并释放治疗性蛋白质神经：基因导入脑循环；基因导入脑脊液；CNS间接打靶技术肝脏：肝脏疾病的基因疗法的重要靶器官胰腺：基因转入胰腺为治疗胰腺癌等提供了可能眼组织：眼组织内注射可作为基因治疗的靶虽然基因治疗法这项技术在许多医疗方面已经获得不少进步，但要想成功地将其运用到医疗实践当中以攻克肿瘤却是任重而道远。（一）“旁观者效应”的作用机制有待进一步研究•“旁观者效应”(by—standereffect)：即导入有自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞也有杀伤作用。•具体作用机制目前有五种观点：缝隙连接、细胞凋亡、机体免疫、介质扩散、肿瘤缺血坏死。•缝隙连接：为大多数研究者所认同。该假说认为转染自杀基因的细胞产生的杀伤性物质是通过细胞间的缝隙连接传递到临近细胞的．这种现象又称之为“死亡之吻”(kissofdeath)。•细胞凋亡：转染自杀基因的肿瘤细胞死亡之后产生凋亡小体，其凋亡小泡包裹着自杀基因的表达产物和一些毒性代谢产物。这些产物被邻近的未转染自杀基因的肿瘤细胞吞噬，从而引起肿瘤细胞的继发凋亡。•免疫作用：转导入肿瘤细胞的HSV—TK可以改变肿瘤组织内的微环境，使之从免疫抑制状态到免疫激活状态。Hogge,-laj和Shi0两学者报道自杀基因引起肿瘤细胞死亡后．释放出肿瘤源性肽类被APC摄取，然后激活CTI细胞．而局部GM—CSF的表达能增强这种抗原递呈功能，从而达到增强旁观者效应。•介质扩散：互相不接触的肿瘤细胞也能发生旁观者效应。在细胞质中的分子和离子．只要其分子量小于1kDa时．它们就可以自由出入细胞。某些自杀基因系统的前体药物在酶的作用下产生有毒性的小分子代谢产物，如CD／5一FC系统的毒性产物5-FU，5-FU能够自由扩散进出细胞将肿瘤细胞杀死•肿瘤缺血坏死：以Ram为首等人发现．由于肿瘤分泌血管生长因子，导致肿瘤内血管的内皮细胞有丝分裂活跃．易于被携带TK基因的逆转录病毒载体所染．经GCV治疗后，肿瘤血管内皮细胞被有效地杀伤．从而抑制了肿瘤血管生长，减少肿瘤的血供，使肿瘤缺血坏死。在肿瘤治疗中，尽管自杀基因疗法具有很大潜力，但目前进行的工作还是探索性的，绝大多数尚处于实验阶段，要使自杀基因治疗成为临床上安全有效的抗肿瘤治疗方法，尚存在许多问题需要解决。（一）还需进一步研究“旁观者效应”的机制•“旁观者效应”(by—standereffect)：即导入有自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞也有杀伤作用。•具体作用机制目前有五种观点：缝隙连接、细胞凋亡、机体免疫、介质扩散、肿瘤缺血坏死•基因治疗的载体系统要求：（1）转导效率高。（2）表达稳定。（3）安全。•目前用于基因转导的载体主要有逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，脂质体等，但各载体各有其优缺点如：•应用较广的鼠源性逆转录病毒MoMLV，感染效率高，能持续表达，较安全但其携带外源基因的容量较小，且感染特异性不高，重组病毒的概率较低。•腺病毒载体的优点是感染效率高，可携带的基因较大，致死性和致瘤性低，使用安全，缺点是不能持续表达，不能反复使用。•因此，还必须加强基因治疗的靶向性研究，开发出新的既安全又高效的载体系统。（三）作用不持久进一步研究自杀基因系统和机体免疫系统的相互作用机制，以激活和增强机体强大而持久的抗肿瘤免疫。新的希望：联合基因治疗联用TK、mIL-2及粒、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因治疗肝转移灶，发现小鼠体内产生的抗肿瘤免疫更持久。鉴于癌症仍为威胁人类健康的一类顽固性疾病，目前的化疗、放疗及手术治疗等方法的作用都有局限，作为新兴的生物疗法中的自杀基因治疗在许多方面都因其独特的作用机制而显示出巨大的潜能．由于目前自杀基因疗法还没有大规模地进入临床实验．所以我们还无法准确预测其在未来癌症治疗中的作用，但或许它就是癌症的终结者。根据目前自杀基因治疗的现状，我们相信这一疗法会在未来有所发展，有所突破，为人类造福。首先，还是如何增强基因转导效率、精确靶向转导、时空调控表达、长效稳定表达以及提高安全性能等问题，这些问题的有效解决尚需新一代载体的开发应用。其次，单一自杀基因系统疗效欠佳，新型融合自杀基因系统的开发与完善是将来的发展方向。再者，对于旁观者效应机制的阐明，还需进一步的深入研究，才能更好地利用此效应最大限度地增强肿瘤杀伤效果，同时避免正常细胞损害。最后，鉴于肿瘤发病中的多因素、多步骤和多阶段的特点以及当前单纯应用自杀基因疗法的局限性，自杀基因疗法联合其它的较成熟抗肿瘤疗法将是未来发展的必然趋势。