循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤干细胞(CTSC)的检测与结直肠癌临床资料的相关性分析

目录第一部分循环肿瘤细胞（CTC）及循环肿瘤干细胞（CTSC）的检测与结直肠癌临床资料的相关性分析中文摘要2英文摘要4前言6材料与方法8结果12讨论17结论27参考文献28致谢32第二部分综述：胃、肠道肿瘤干细胞的研究进展综述33参考文献37循环肿瘤细胞（CTC）及循环肿瘤干细胞（CTSC）的检测与结直肠癌临床资料的相关性分析中文摘要目的：通过检测结直肠肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTC）以及循环肿瘤干细胞(circulatingtumorstemcells,CTSC)，分析其数目与患者临床分期、肿瘤淋巴结转移、肿瘤远端转移等的相关性，验证它们作为患者预后评判指标的可行性，初步探讨CTC及CTSC与肿瘤转移的相关性。方法：本论文入组首诊初治结直肠癌患者50人，在其手术治疗前，以及治疗后一周各抽取外周血15ml，利用Ficoll淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞后，平均分成两份：CTC组标记表面标记物--CD45、EpCAM、CK，CTSC组标记表面标记物--CD45、EpCAM、CD44、CD133，并利用超高速流式细胞分选仪MOFLOXDP进行CTC及CTSC的检测分析。结果：判定CD45-/EpCAM+/CK+细胞为CTC，CD45-/EpCAM+/CD44+细胞为CTSC1，CD45-/EpCAM+/CD133+细胞为CTSC2，CD45-/EpCAM+/CD44+/CD133+细胞为CTSC3。判定手术前（手术后）检测出CTC≥2个/7.5ml外周血者为阳性结果，CTC2则为阴性；CTSC1≥1个/7.5ml外周血者为阳性结果，则CTSC11为阴性；CTSC2≥1个/7.5ml外周血者为阳性结果，则CTSC21为阴性；CTSC3≥1个/7.5ml外周血者为阳性结果，CTSC31为阴性。结果显示：（1）结直肠癌患者手术前CTC阳性检出率为34%，CTSC1阳性检出率为44%,CTSC2检出率为4%；手术后CTC阳性检出率为38%，CTSC1阳性检出率为54%，CTSC2阳性检出率为6%，均较术前增高但并不具有统计学意义；手术前后的样本均未检测出CD44、CD133双阳的细胞，CTSC3阳性检出率为0%。（2）手术前CTC与肿瘤的大小、T分期（浸润深度）有关（P均小于0.05），与患者年龄、性别、TNM分期、N分期及M分期都不具有显著相关性；而手术后CTC则与肿瘤的T分期、N分期（淋巴结转移）、M分期（远处转移）均具有显著相关性（P均小于0.05），与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期不具有显著相关性。（3）手术前CTSC1与肿瘤的T分期有关（P0.05），与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、N分期及M分期都不具有显著相关性；而手术后CTSC1则与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、T分期、M分期及N分期均无显著相关性（P0.05）。（4）综合术前、术后CTC、CTSC1的指标与肿瘤的TNM分期和M分期具有显著相关性(P0.05)，与N分期也有一定的相关性（P=0.063）。结论：（1）CTC与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及远处转移密切相关。（2）CTSC1与肿瘤的浸润深度具有相关性。CD44作为结直肠癌CTSC的检测指标优于CD133。（3）CTSC的检测可能是CTC检测的有益补充。关键词：CTC，CTSC，CD44，CD133，结直肠癌Circulatingtumorcells(CTC)andCirculatingtumorstemcells(CTSC)incolorectalcancer:correlationwithclinicaldatavariablesAbstractObjectiveToidentifyCTC(circulatingtumorcells)andCTSC(circulatingtumorstemcells)fromperipheralbloodinpatientswithcolorectalcancer,andfurtheranalyzethecorrelationofCTCandCTSCnumberwithclinicalstages,lymphnodemetastasis,andtumordistalmetastasisofcancer.ToverifyifCTCandCTSCcanbeevaluatedprognosticandaccordedtodistantmetastasis.MethodsAltogether50colorectalcancerpatientswhohaveneverreceivedanytreatmentbeforewererecruited.15mlperipheralbloodwasdrawnfromeachpatientattwotimepoints:oneweekbeforesurgeryandoneweekafter.Ficollwereusedtoseparatethebloodmononuclearcellsfromperipheralblood.Cellswereaveragedintotwoportions,andtagedrespectivelywithcirculatingtumorcellssurfacemarkers:CD45,EpCAMandCK,orwithcirculatingtumorstemcellssurfacemarkers:CD45,EpCAM,CD44andCD133.Ultrahighspeedflowcytometrysorter(MOFLOXDP)wasusedtoanalyzeCTCandCTSCnumber.ResultsWeidentifiedCD45-/EpCAM+/CK+cellsasCTC,CD45-/EpCAM+/CD44+cellsasCTSC1,45-/EpCAM+/CD133+cellsasCTSC2,45-/EpCAM+/CD44+/CD133+cellsasCTSC3.Weregarded2CTCsandoverper7.5mlperipheralbloodaspositiveresults,andlessthan2asnegative;oneCTSCandoverper7.5mlperipheralbloodaspositiveresults,thenCTSClessthan1wasnegative.Andtheresultsshowasfollows:(1)Forthosepatientswithcolorectalcancerbeforesurgery,CTCdetectedrateis34%,CTSC1detectedrateis44%,CTSC2detectedrateis4%;andafterthesurgery,CTCdetectedrateis38%,CTSC1detectedrateis54%,CTSC2detectedrateis6%,arebothhigherthanthatofbeforesurgery,butdon’thavestatisticalsignificance.Wedidn’tfindCTSC3neitherpreoperativenorpostoperative,theCTSC3detectedrateis0%.(2)PreoperativeCTCnumberisrelatedwiththetumor’ssizeandTstages(infiltratingdepth)(P0.05);WhilepostoperativeCTCnumberhassignificantcorrelationwithTstages,NstagesandMstages(distantmetastasis)(P0.05);Bothpre-orpost-operationCTCnumberareirrelationtopatients’age,sexandTNMstages(P0.05).(3)Beforetheoperation,CTSC1isassociatedwiththeTstagesoftumor(P0.05),whereaspostoperativeCTSC1numberisnotsignificantcorrelatedwithpatients’age,sex,tumorsize,TNMstages,Tstages,NstagesandMstages(P0.05).(4)IntegratedCTCandCTSC1numberbothbeforeandaftersurgeryhavesignificantwithtumordistantmetastasisandTNMstages(P0.05),andarealsocorrelatedwithNstages(P=0.063).Conclusions(1)CTCnumberhassignificantcorrelationwithTstages,NstagesandMstages.(2)CTSC1numberhassignificantcorrelationwithTstages.CD44asaCTSCsurfacemarkerisbetterthanCD133incolorectalcancerpatients.(3)Thecirculatingtumorstemcellsareusefulforcirculatingtumorcellsdetection.Keywords:circulatingtumorcells(CTC);circulatingtumorstemcells(CTSC);CD133;CD44;colorectalcancer前言结直肠癌是目前世界发病率第三高的癌症，据2013年最新统计显示肠癌每年新增患者人数约94万人，死亡病例约60.8万[1]。近年来，伴随着生活条件的改善，我国居民的生活方式发生了很大程度的改变，西化的饮食结构和习惯促使我国结直肠癌的发病率及死亡率逐年攀升[2,3]。尽管医疗技术日益更新，目前肠道肿瘤的诊断方法和临床治疗策略都有了较大的改进，但患者总体预后仍差，复发率和转移率高[4]。肿瘤的复发和转移是结直肠癌患者预后不良的根本原因。近年来的研究发现癌症病人外周血中存在少量的肿瘤细胞，它在肿瘤的复发、转移、耐受抗肿瘤治疗等方面发挥重要作用，这些细胞被称为循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCells,CTC）。循环肿瘤细胞来源于从实体瘤脱落进入外周循环系统中的肿瘤细胞[5]。目前认为外周血中呈现CD45-/EpCAM+/CK+的细胞为CTC，其数目的多少，与肿瘤患者的临床分期、肿瘤淋巴结转移、肿瘤分化程度及预后密切相关[6]。外周血中的CTC大部分进入凋亡途径，仅少数通过EMT形成循环肿瘤干细胞（circulatingtumorstemcell，CTSC），这些细胞具有与干细胞相似的生物学特性，能够自我更新、不断的增殖分化、迁移和侵袭能力强，并能够在微环境适宜时形成转移灶[7,8]。一些研究发现CTC同时拥有原发性肿瘤细胞的表观遗传学和基因遗传学特征[9]。对CTC分子特性的深入研究有助于进一步了解肿瘤转移的机制，有助于研发更有效的肿瘤诊疗方法，可为肿瘤的靶向治疗及减少肿瘤的复发和转移治疗提供新的理论依据。另外，CTC对结直肠癌患者发生远处转移的预测时间比常规的肿瘤标记物如CEA、CA-199等提早一年左右。CTC的检测是转移患者的早期诊断、治疗后肿瘤的复发和转移的实时监测、肿瘤靶向治疗药物的敏感性筛查、患者预后的判断以及个体化治疗策略制定等的一种比较理想的新型工具。循环肿瘤细胞（CTC）及肿瘤干细胞（CTSC）的鉴定与富集及其分子生物学特性是目前肿瘤领域的研究热点。检测外周血中CTC和CTSC的表达水平，可作为肿瘤的“液体活检”指标，具有重要的临床应用价值。外周血循环