第七章 生物样品内中药制剂化学成分分析

第七章生物样品内中药制剂化学成分分析大纲要求了解体内中药制剂分析的性质、意义和任务熟悉中药制剂在生物体内的存在状态与生物转化、生物样品内药物分析方法掌握体内中药制剂样品的制备方法及注意事项掌握生物样品内中药制剂化学成分分析方法的建立第一节概述一、生物样品内中药制剂化学成分分析的意义和任务含义：体内中药制剂分析又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门研究生物机体中药物及其代谢产物或内源性物质质与量变化规律的新兴学科。第一节概述（一）生物体内中药制剂分析的意义研究中药制剂在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从而为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对所研究药物作出估计与评价。ADME/Tox第一节概述（二）体内中药制剂分析的主要任务1.分析方法学的研究关键性问题2.生物样品内中药制剂成分研究原型药物、代谢产物3.生物样品内内源性物质的测定和研究代谢组学第一节概述二、体内中药制剂分析的对象（一）分析对象体液、器官、组织、排泄物等大鼠、兔、狗、猴、人母体药物代谢产物第一节概述（二）体内中药制剂分析的特点1.干扰杂质多：内源性物质，如蛋白质、多肽、脂肪酸、色素、酶等；代谢物、共存药物等2.样品量少：生物体采样量受限3.分析方法要求高：高选择性、灵敏度第二节中药制剂化学成分在生物体内的存在状态与生物转化一、中药制剂化学成分在生物样品内的存在状态二、药物代谢第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化一、存在状态游离药物结合药物蛋白质结合不能透过细胞膜可逆第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化（一）与血浆蛋白结合可逆的结合/非特异性的结合白蛋白/酸性糖蛋白/脂蛋白结合与解离动态平衡Cb/Cf：血浆蛋白结合率0—0.9：大于0.9高结合率，小于0.2低结合第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化（一）与血浆蛋白结合影响因素：药物浓度、药物与蛋白结合点的亲和力、蛋白结合点的数量年龄:新生儿、老年人低第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化（一）竞争血浆蛋白结合的中药制剂化学成分间的相互作用理化性质相似的成分第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化二、药物代谢（Drugbiotransformation)药酶的作用下经历化学结构变化的过程1.药物的代谢部位及化学途径肝脏、肾、脾、肺、肠粘膜、血浆、皮肤等肝微粒体、线粒体、胞浆中存在的药物代谢酶生物体内药物代谢酶及其特性（熟悉）第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化药物代谢研究的意义了解药物进入生物体后的状态、与生物系统的相互作用，保证临床用药安全、有效研究药物的代谢途径、酶催化机制、结构与药理作用的关系，对避免药物的毒性及寻找新药具一定意义研究药物相互作用、毒性作用机制，使临床用药更加安全、合理第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化二、药物代谢（Drugbiotransformation)药酶的作用下经历化学结构变化的过程2.药物代谢的反应类型氧化还原水解第一相反应结合反应：第二相反应第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化举例川芎嗪：主要是氧化代谢第三节生物样品的制备一、选择体液或组织供体内药物分析的一般原则二、常用生物样品的种类、特点与采集三、样本的代表性四、样品的储存五、样品的预处理第三节生物样品的制备一、选择体液或组织供体内药物分析的一般原则：1、能够反映出浓度与药效之间的关系2、易于获得3、便于处理、适合分析4、根据不同检测目的与要求进行选取第三节生物样品的制备二、常用生物样品的种类、特点与采集按照生物样品的性质，生物样品可分为：均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液等非均匀样品：心、肝、脾、肺、脑等器官组织第三节生物样品的制备二、常用生物样品的种类、特点与采集（一）血样（二）尿液（三）唾液（四）胆汁（五）脏器组织第三节生物样品的制备（一）血样1、采血方式及评价多用静脉采血注意：将注射器内取好的血液转入试管或其他容器时，应注意勿用力压出，而应取下针头后轻推，以免血球破裂使血浆（或血清）带红色。第三节生物样品的制备2、全血、血浆和血清样品的制备血液自然凝结离心上层：血清（40％）下层：血细胞加抗凝剂离心上层：血浆（50％）下层：血细胞全血第三节生物样品的制备2.1抗凝剂的选择：肝素最常用，一般不会干扰药物分析及导致药物发生化学变化枸橼酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）：能与血中Ca2+结合，可能引起被测组分发生化学变化或干扰药物的测定肝素是一种含硫酸的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，能阻止凝血酶原转化为凝血酶，抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，一般1ml血液需要用肝素0.1~0.2mg，血液放入有抗凝剂的试管后轻轻旋摇容器，但勿太猛烈。第三节生物样品的制备3.全血、血浆和血清样品的应用3.1血清和血浆可任意选用，测定方法可通用，但血浆量多应用方便，若血浆内抗凝剂对药物分析有影响，则应使用血清样品血药浓度均指血浆或血清中的药物总浓度（游离的和与血浆蛋白结合的总浓度）（微透析技术除外）第三节生物样品的制备3.2全血：不能很好反映药物的药理作用强度，不能作为作用部位药浓的可靠指标（血细胞中的药物暂时仅作为“储库”，失去药理作用）第三节生物样品的制备血样的特点：缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药物监测第三节生物样品的制备（二）唾液可用作药物浓度检测及药代动力学研究唾液中药物浓度通常与血浆浓度相关，比血浆药物浓度低收集方法：漱口后15min收集不同唾液腺分泌不同的唾液，成分不尽相同个体差异大第三节生物样品的制备（三）尿液用于药物剂量回收、药物肾清除率及代谢类型等研究体内中药清除主要是通过尿液排出，药物以原型、代谢物、缀合物形式排出收集方法：规定的时间内采集尿液第三节生物样品的制备1.特点1.1尿中药物浓度改变不直接反映血药浓度1.2尿液药物浓度较高，收集量大，但浓度变化较大，要测定一定时间内尿中药物总量，需要记录排出的尿液体积及尿药浓度1.3短时间内不能多次取样，排尿时间较难掌握及不易采集完全等缺点第三节生物样品的制备（四）胆汁阐明药物的胆汁排泄率及药物的体内动态特性方法：胆汁引流规定时间内收集胆汁计算累积排泄量第三节生物样品的制备（五）脏器组织用于研究成分在各器官、组织的分布、积蓄或代谢研究脏器组织可与成分形成强烈结合分离分析前，需预先制成1：5或1：10匀浆，提高溶剂抽提率，降低组织空白值，避免乳化第三节生物样品的制备三、样本的代表性1、取样条件标准化（摄取标准膳食、控制饮水量等）2、取样时间及其间隔一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20冷藏或冷冻1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小体积分装存放。第三节生物样品的制备第三节生物样品的制备五、样品的预处理（掌握）目的1.药物从缀合物中释放，测定总浓度2.纯化、富集药物3.适应和满足测定方法要求的灵敏度4.防止对分析仪器的污染和劣化第三节生物样品的制备五、样品的预处理（掌握）（一）提取方法的选择依据（二）药物的提取（三）药物的分离与净化（四）待测组分的富集（五）衍生物处理第三节生物样品的制备（一）提取方法的选择依据1.药物的理化性质2.药物的浓度范围3.药物测定的目的4.生物样品的类型5.样品处理与分析技术的关系第三节生物样品的制备（二）药物的提取1、蛋白质处理：干扰分析、污染测定条件2、缀合物水解：测定母体药物3、水溶性强的药物：冷冻干燥，冻干后进行液－固萃取第三节生物样品的制备1、蛋白质处理①加入与水相混溶的有机溶剂有机溶剂使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化沉淀剂：乙腈（2倍）、甲醇（3倍）乙醇、丙酮：很难挥干浓集超速离心（10000r/min）去除90％蛋白加保护柱第三节生物样品的制备1、蛋白质处理②加入中性盐蛋白质脱水沉淀沉淀剂：硫酸铵、硫酸钠、镁盐、枸橼酸盐1：290％去除超速离心（10000r/min）第三节生物样品的制备1、蛋白质处理加入强酸常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液体积比：1：0.690％去除方法：超速离心（10000r/min）第三节生物样品的制备1、蛋白质处理③沸水浴④超滤、透析法（游离药物浓度）第三节生物样品的制备2、缀合物水解含义：中药制剂待测成分或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物特点：缀合物极性较母体药物大，亲水性强，不易被有机溶剂提取，需水解处理第三节生物样品的制备2、缀合物水解水解方法：酸水解，酶水解（葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶），溶解剂趋势：直接测定缀合物的量，了解药物代谢情况第三节生物样品的制备3、冷冻干燥特点：适合于一次不能完成分析的大批量生物样品、水溶性样品、挥发性样品和对热不稳定的样品方法：干冰－丙酮浴、用液氮、冷冻干燥仪第三节生物样品的制备（三）药物的分离和净化1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)2、液－固萃取(liquid-solidextraction,LSE)第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)大多数药物都是脂溶性的，内源性物质基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)关键要考虑三个方面的因素：（1）有机溶剂的特性（2）有机溶剂相和水相的体积（3）水相的pH值第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)萃取率应不低于50％影响提取率的因素：①水相的PH值②提取溶剂：低沸点、低毒性（乙酸乙酯）、无水Na2SO4脱水③离子强度：加入氯化钠，有利于提取，减少乳化1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE血浆或其他生物样品加入萃取溶剂分取有机层必要时调pH值减压氮气吹干流动相溶解后进样分析1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE消除LLE中产生的乳化现象：1、提取前在水相中加入适量的固体食盐2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层，再融化后离心来消除已产生的严重乳化现象第三节生物样品的制备2、液－固萃取（liquid-solidextraction,LSE)原理：利用固体材料作为固定相，当含多组分的生物样品溶液通过时，固定相对各组份具有不同的亲和性，一些组分受到“分配”或“吸附”作用而滞留在固定相上，当使用流动相冲洗时，由于流动相对组分的亲和性更强，随按组分洗脱的难易，将其依次携带出柱，使之达到分离。第三节生物样品的制备LSE与LLE相比其优点①固相与体液样品接触时很少引入外源性杂质②不会形成乳化现象③萃取效率高，可减少生物样品的用量④萃取操作可在室温进行，适于处理挥发性及对热不稳定的药物第三节生物样品的制备LSE与LLE相比其缺点①不同的药物应选择合适的固定相，并且应试验洗脱时间和筛选合适的洗脱系统。②血浆样品反复冻凝和解冻后，会产生絮状蛋白沉淀，阻塞固相提取柱，需先离心除去后再上柱③不同批号的固相之间对药物的萃取回收率有差异第三节生物样品的制备（四）待测组分的富集方法：挥去萃取溶剂法1.直接通入气流吹干气体：压缩空气，氮气（易氧化的被测组分）注意：1.