第十二章 植物脱毒技术

植物组织培养GoodMorning第十二章植物脱毒技术目的与要求了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及其操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用，掌握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴定方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱毒苗的保存和繁殖方法。具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知。•全世界已发现植物病毒有近788种。•病毒的危害：•1、组织和细胞病变•2、新陈代谢等生理机能受到干扰•3、外观表现不正常状态•由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程度仅次于真菌。甘蔗黑穗病2006年，这一疾病能使作物的生长速度与收成降低百分之三十，从而使澳大利亚昆州总值十五亿澳元的蔗糖产业受到灾难性威胁。有关方面还发现这一疾病已经传染至该农场中的许多其它作物。感染黑穗病的作物呈现弯曲状，从作物顶部朝下呈灰至黑色。马铃薯病毒病马铃薯新品种推广后，随着种植年限的增加，产量逐年下降，植株变矮，薯快变小，并伴有茎叶异常现象，如花叶、叶片卷曲或皱缩等。这种现象称之为退化。引起马铃薯退化的主要原因就是病毒病。花卉一般来说，病毒侵染花卉后，使花卉表现褪色、组织坏死和畸形等症状。但是，有些情况，使花卉的叶和花发生变异而更具有观赏价值。菊花中的“绿牡丹”,由于受病毒和类菌原体的侵染，使菊花花冠卷曲，花朵呈绿色，而且通过无性繁殖，可以保存下来。“矮化因子”实际是一种侵染植物的病毒，它引起一些木本植物的矮化，可以将它们利用到果树栽培和盆景制作中去。12、1引言多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身浸染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类菌质体，因而每年都必须更新母株。病原菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。然而，在植物中病毒的存在会减少作物的产量和（或）品质。据报道，当以特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，产量最多可增加300％（平均为30％）。•因此，为了提高产量和促进活体植物材料的国际交换，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过杀细菌和杀真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。作物，特别是无性繁殖。•由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。如果在一个品种中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。•但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，然后就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。•众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是：①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖；②、在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制；③、倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染；④、在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。•茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌等）。•通过大量的实验以后，茎尖培养方法得到了长足的发展，现以成为最有效的获得无毒植物的方法，成功的用于多种栽培植物。现在这一方法已在园艺上得到了普遍应用。在茎尖培养法建立之前，在活体上消除病毒的方法是对整个植株进行热处理。12、2“无病毒”词义辨析•所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。•无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。•植物常常受到不止一种类型病毒的侵染，而且可能还带有某些未知病毒。•因此，只有当某些病毒在特定的检验中为负结果时，才能说该植物不带有那些病毒。•在本书中，为了方便起见，“无病毒”一词应带有“特定无病毒”的涵义。危害一些植物的病毒数目物种感染病毒种类物种感染病毒种类物种感染病毒种类菊花19矮牵牛5苹果36康乃馨11百合6柑橘23水仙4马铃薯17葡萄26唐菖蒲5大蒜24草莓24风信子3豌豆15桃23月季10樱桃44梨11植物脱毒的意义•1、能够有效地保持优良品种的特性。任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。•离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。•2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用。离体繁殖周期短•◆不受季节限制•◆繁殖系数高•◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的•又称之为快繁。•3、生产无病毒种苗，防止品种退化。•4、节约耕地，提高农产品的商品率•5、便于运输。常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。•离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。12、3植物脱毒的原理和方法（一）植物脱毒原理：1）植物病毒本身不具有主动转移的能力。•在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制。3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。（二）植物脱病毒方法物理方法化学方法生物方法高温处理茎尖培养微体嫁接珠心培养愈伤脱毒热处理脱毒1、通过热处理消除病毒基本原理：在高于正常的某一温度范围（35－40℃)下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完全钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。•热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。•作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。植物生长区与热处理区关系图解•香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。•马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。热空气处理脱毒法•试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。•生长室温度35-40℃•光照3000—10000lx热处理，可通过热水或热空气进行。热水对休眠芽效果较好；热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄主植物又较高的存活机会。热空气处理比较容易进行：把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中，在35~40℃处理一定时间即可。处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。•热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。而且要对植物进行修剪，以增加植物忍受热处理的能力。热处理的优缺点•优点:方法简单，效果明显。•缺点:•1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。•2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失•3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。和单独采用热疗法相比，茎尖培养具有更广泛的适用性。很多不能由单独的热处理消除的病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎尖培养而消除。因而，茎尖培养现在已经成为消除病毒的一个很常用的手段。12、4通过茎尖培养消除病菌•1）原理及依据•病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少•病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争•2）操作程序•外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。12、4、1外植体名称在应用组织培养方法以获得无病菌植物时，所用的所用的外植体可以是茎尖，也可以是茎的顶端分生组织。在这里，顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为100um，最大长度约为250um。茎尖是由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的（如图13、2），虽然通过顶端分生组织培养消除病毒的机会较高，但在大多数已发表的的工作中，无毒植物都市通过茎尖培养得到的。12、4、2剥取茎尖的方法•解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。•茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。•在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。对于难以生根的要嫁接到健康的砧木上。•注意，不要太大，以免带有较老的组织。1、茎尖脱毒方法1）取样与消毒可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种。消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿•2、茎尖剥离和接种•将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。酒精擦拭旋转灼烧显微镜下获取茎尖接种盖好瓶塞脱毒马铃薯试管苗•3．培养25+2℃，1500-5000LX，10-16h一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。4．生根诱导诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。12、4、3在茎尖中影响脱毒效果的因素•（一）培养基MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。下表是几种常用于茎尖培养的培养基。虽然较大的茎尖外植体（500μm）或更长在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株，但一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。（二）外植体大小•在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200μm长的外植体能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。用于脱毒的适宜茎尖大小植物病毒名称剥离茎尖大小（mm）植物病毒名称剥离茎尖大小（mm）马铃薯马铃薯卷叶病毒1.0～3.0百合花叶病0.2～1.0马铃薯Y病毒1.0～3.0鸢尾花叶病0.2～0.5马铃薯X病毒0.2～0.5菊花各种病毒0.2～1.0马铃薯G病毒0.2～0.3康乃馨各种病毒0.2～0.8马铃薯S病毒0.2以下大丽花花叶病0.6甘薯斑纹花叶病毒1.0～2.0大蒜花叶病毒0.3～1.0缩叶花叶病毒1.0～2.0甘