高效液相色谱法--48页PPT文档

返回章目录高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography分析化学教研室高效液相色谱仪分析流程仿真系统返回章目录高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6小结习题及解答返回章目录一、概述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。简称：HPLC；HRLC；SPLC；UPLC超高效液相色谱（UltraPerformanceLiquidChromatography）与经典LC相比——高效◇高效填料：3～5μm◇高压泵输液◇高灵敏度的检测器:在线检测返回章目录一、概述分析对象流动相差别GC•能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%•惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别返回章目录一、概述HPLC仪器示意图返回章目录一、概述Agilent1100返回章目录一、概述HPLC仪器图SHIMADZUAGILENTWATERS返回章目录一、概述application返回章目录高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6返回章目录二、基本原理范氏方程（VanDeemterequation)：重要GC：填充柱H=A+B/u+Cu开口毛细管柱H=B/u+CuHPLC：H=A+Cu原因：T↓；η↑；u↑→忽略B/u2mBDmTD返回章目录二、基本原理GC和HPLC的H-u图(1)B/u(2)Cu(3)A(4)HPLC的uopt(5)GC的uopt返回章目录二、基本原理HPLC：H=A+CuA=2λdpC=Cm+Csm影响因素：•λ↓选球形固定相，高压、匀浆装柱法•dp↓选粒径小的化学键合相•C↓选粘度小、低流速的流动相范氏方程（vanDeemterequation)返回章目录高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6返回章目录三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）1液液分配色谱法（LLC）2化学键合相色谱法（BPC）3返回章目录三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心固定相:硅胶流动相:底剂（烷烃）+极性调节剂出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱例如：TLC返回章目录三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分类:概念及保留行为（重要）正相色谱NPLC•固定液极性流动相极性•极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱反相色谱RPLC•固定液极性流动相极性•极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法(bondedphasechromatography，BPC)概念：固定液的官能团通过化学反应键合在载体表面反相键合相离子抑制正相键合相离子对返回章目录三、各类高效液相色谱法1.反相键合相色谱法(RBPC)分离机制：疏溶剂理论等固定相：非极性的键合相如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱)流动相：极性大的流动相如:甲醇-水或乙腈-水流动相极性与k的关系:极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑极性大的组分先出柱应用：非极性--中等极性组分(80%)返回章目录三、各类高效液相色谱法2.正相键合相色谱法(NBPC)分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓结构相近组分，极性大的组分后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法3.离子对色谱法(IPC,PIC)分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成不带电的中性离子对，以改善分离机理：流动相固定相B+H+BH++RSO3NaRSO-3+Na+[BH+.RSO-3][BH+.RSO-3]中性离子对↗增加了在非极性固定相中溶解度。返回章目录三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象离子对试剂例如碱烷基磺酸钠C5、C6、C7、C8磺酸钠,SDS酸四丁基季铵盐四丁基胺磷酸盐（TBA）返回章目录三、各类高效液相色谱法4.离子抑制色谱法(ISC)分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的适用范围：3.0≤pKa≤7.0的弱酸7.0≤pKa≤8.0的弱碱抑制剂:弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6返回章目录四、固定相液-固色谱固定相载体：硅胶无定形全多孔硅胶YWG球形全多孔硅胶YQG高分子多孔微球YSG特点：柱选择性好，峰形好，柱效低返回章目录四、固定相化学键合相特点：不易流失；热稳定性好；化学性能稳定载样量大；适于梯度洗脱分类：非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相返回章目录四、固定相非极性键合相：ODS载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6返回章目录五、流动相要求：与固定液不反应；对样品有良好溶解度粘度小；与检测器匹配22114kknRα与固定相性质和流动相种类有关k与流动相配比有关返回章目录五、流动相正相洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱反相洗脱流动相的极性大于固定相的洗脱洗脱方式：等度洗脱(isocraticelution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradientelution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例返回章目录五、流动相返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站高效液相色谱仪HPLC返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站泵：恒压泵恒流泵:柱塞往复泵返回章目录六、高效液相色谱仪Agilent二元泵示意图返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成分析柱φ2-4.6mmL10-25cm常量柱φ1-1.5mmL10-20cm常微量柱制备柱φ20-50mmL3-25cm返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:1.紫外检测器2.荧光检测器3.蒸发光散射检测器4.其它检测器返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站返回章目录六、高效液相色谱仪T/min波长(nm)色谱－光谱图返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS返回章目录六、高效液相色谱仪超高效液相色谱仪(waters)返回章目录小结熟悉掌握了解•HPLC的特点.•HPLC的仪器结构及各部件.•HPLC中色谱条件的选择.•化学键合相色谱法.•范氏方程在HPLC的表达形式.•分离度影响因素•正相色谱和反相色谱.返回章目录习题及解答3.HPLC流动相的pH值应控制为___________小于H=A+Cu2-81.反相色谱中固定相的极性流动相的极性.2.HPLC中范氏方程的表达式为:____________________填空题：返回章目录习题及解答1.键合相的键合基团的碳链长度增长后()A.极性减少B.极性增大C.载样量增大D.载样量减少2.提高色谱柱柱效的可行方法是()A.选择小粒度的固定相B.降低固定相的粒度分布C.选择球形固定相D.匀浆装柱E.增加柱长F.选择适宜流动相G.降低流速ACABCD选择题：返回章目录习题及解答计算题：1.用15cm长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条件下柱效n=2.84×104m-1，用苯磺酸溶液测得死时间t0=1.31min，测得tR1=4.10min及tR2=4.38min。求：（1）k1、k2、α、R；（2）若增加柱长至30cm，分离度可否达到1.5？返回章目录习题及解答解：（1）同理：24.381.312.341.31k212.341.102.13kk2211.041knRk（2）211222RLRL2221.00.150.30R21.4R13.231.131.110.4000'111tttttkRR返回章目录分析化学教研室谢谢！END