ABI7500-Fast-PCR作业指导书

1、目的规范该型号ABI7500Fast荧光定量PCR仪操作程序，正确使用和维护仪器，保证检测工作顺利进行，操作人员人身安全和设备安全。2、适用范围适用于ABI7500Fast荧光定量PCR仪的使用操作与维护。3、职责3.1操作人员按照本规程使用仪器，对仪器进行日常维护。3.2保管人员负责对仪器进行定期维护、保养。3.3科室负责人监督检查本操作程序的执行。4、操作程序4.1启动笔记本电脑，进入WindowsXP系统。4.2待电脑桌面图标出现后，打开ABI7500Fast荧光定量PCR仪主机电源。4.3待主机电源指示灯亮后，双击电脑桌面7500SDS图标，打开软件。4.4新建文件：在QuickStartupdocument窗口点击CreateNewDocument按钮，出现NewDocumentWizard窗口，在Assay菜单中选择StandardCurve（AbsoluteQuantification），点击Finish按钮后打开一个空白96孔板文件。4．5探针设置：双击任意一个孔打开WellInspector窗口。4．6点击AddDetector按钮，打开DetectorManager窗口，选择DetectorList中的探针，例如用的是TaqMan-FAM标记探针，在列表中选择Reporter：FAM，Quencher：TAMRA；如果用的是SYBRGreenI，则在列表中选择Reporter：SYBR，Quencher：（none）。选择所需探针，按住Ctrl键可选择多个探针，再点击AddToPlateDocument按钮，最后点击Done按钮关闭DetectorManager窗口。此时WellInspector窗口仍然是打开的。填样品表：在96孔表中选择有样品的一个或者多个孔，然后在WellInspector窗口的SampleName输入样品的名称，在探针列表中的Use项下的方框中打钩选择要用的探针，在Task栏中选择指定样品类型：未知样品选择Unknown，阴性对照选择NTC，标准品选择Standard。对于Standard，还要在Quantity栏中输入对应DNA的拷贝数。注意如果没有输入拷贝数，软件将不能自动生成标准曲线。已设定过的PlateDocument显示，同时右下方的Status显示“Connected”。4．7参比荧光：如果所用的定量PCR试剂含有ROX参比荧光，则在参比荧光栏（PassiveReference）选择ROX；如果所用的定量PCR实际不含有参比荧光，则选择（none）。完成后点击Close按钮关闭WellInspector窗口。4．8循环参数：切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序。删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，使该步骤被选中变黑，再按Delete键即可删除。插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击AddHold、AddCycle或AddStep按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。Reps栏可输入循环数，SampleVolume(ul)栏输入反应体积。融解曲线试验：点击AddDissociationStage按钮，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBRGreenI染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注意：只有SYBRGreenI染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。RunMode：Standard7500,模块的升降温速率为2.5℃/sec。DataCollection:选择在退火温度步骤收集荧光信号，以黄色背景显示。4．9启动扩增：确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当，点Save按钮保存文件设置，保存类型选SDSDocuments(*.sds)。点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。4．10监控进程:切换到Results页面的AmplificationPlot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC，只显示对应探针的变化情况；如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。4．11保存结果：程序结束后，点Disconnect按钮，然后File→Save保存实验结果。4．12关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭ABI7500SDS软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。5、日常维护方法。5.1每周检查计算机磁盘空间；整理计算机硬盘驱动器碎片；归档或备份您的实验文件。用不脱毛布块清洁PCR仪的表面。5.2严格按操作规程工作，出现异常情况立即关机，并请专业人员维护。5.3实验室应定期做好清洁并开窗通风以防止交叉污染。5.4使用前应进行仪器自检一次，自检正常方可使用。5.5每次使用后，应做好清洁工作，罩上防尘罩。每月对仪器清洁、保养、维护一次。6、支持文件ABI7500Fast荧光定量PCR仪使用说明书。7、质量记录表格仪器设备使用登记簿。