SDS尿蛋白及本周氏电泳的意义

SDS尿蛋白电泳王连升法国Sebia公司上海代表处肾病的现状肾脏疾病：慢性隐匿，发病率急剧上升，早期就诊率20-30%，部分患者首诊即终末期肾功能衰竭慢性肾功能衰竭（CRF）是各种慢性肾脏病（CKD）的最终结果CRF并发症严重,死亡率高严重危害人类健康的全球性的公共卫生问题肾单位的生理结构和各类生理蛋白2百万个肾单位每天过滤180升的血浆同时产生大约1.5升的尿液。肾小管的废弃物排放最后形成的尿液含有1/3的白蛋白和2/3球蛋白肾小管重新吸收白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白肾小球过滤白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白尿里的蛋白在生理学角度讲，正常的人的尿蛋白量小于150mg/24h(大约在100mg/L)主要的蛋白是白蛋白(少于30mg/L)病理上的肾功能疾病：当尿蛋白量大于150mg/24h而此时，尿蛋白的成分也是不定的。尿蛋白含量增加的原因间歇性的生理因素：食高蛋白饮食后，精神激动、剧烈运动、长时间受寒，站立过久,病理性的：●肾前性（溢出性）●肾性●肾后性●肾小球损伤●肾小管损伤●混合性●选择性●非选择性67kDa67kDa溢出性蛋白尿血浆中相对分子质量较小或阳性电荷蛋白异常增多经肾小球滤过，超过肾小管重吸收能力形成蛋白尿。肾小球滤过、肾小管重吸收均正常。7常见蛋白种类及疾病游离轻链见于多发性骨髓瘤ß2微球蛋白见于淋巴组织增生综合征溶菌酶见于部分急性粒细胞白血病血红蛋白溶血性疾病,血型不合输血α1酸性糖蛋白见于支气管肺癌肌红蛋白挤压伤,心肌梗死……肾前性(溢出)蛋白尿肾后性蛋白尿•来源于肾小管代谢产生的、组织破坏分解的、炎症或药物刺激泌尿系统分泌的蛋白质，进入尿液而形成的蛋白尿。肾性蛋白尿•肾小球性蛋白尿肾小球滤过膜因炎症、免疫、代谢等因素损伤后滤过膜孔径增大、断裂和（或）静电屏障作用减弱。根据滤过膜损伤程度及尿蛋白的组分，尿蛋白分为2类：（1）选择性蛋白尿（selectiveproteinuria）：相对分子质量中等的清蛋白为主（2）非选择性蛋白尿（non-selectiveproteinuria）：以相对分子质量较大和中等的蛋白质同时存在为主。反映肾小球毛细管壁有严重断裂和损伤。•肾小管性蛋白尿肾小管在受到感染、中毒损伤或继发于肾小球疾病时，因重吸收能力降低或抑制，而出现的以相对分子质量较小的蛋白为主的蛋白尿。肾小球过滤•大分子量蛋白（主要为＞67kDa）无法透过肾小球进入肾小管•其他决定各种蛋白被过滤的因素:分析形状,带电量,血浆浓度.•还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.肾小球损伤•原因–糖尿病–感染性损伤(细菌感染,乙肝患者,水痘,梅毒,单核白血球增多症,…)–其他系统性疾病(自动免疫系统,癌症,…)–中毒现象(重金属,药物中毒,…)•此时,我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白(大于67kDa)。肾小管的再次吸收功能•在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白，分子量小于67kDa,将会在肾小管内被重新吸收(内吞作用).99%的在肾小球内被过滤的蛋白,都将会被重新吸收利用.例如,18g/24-h白蛋白将会被过滤掉;30mg/24-h白蛋白在人的尿液中被发现.肾小管损伤•肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力(小于67kDa的蛋白)•产生原因–遗传原因(Fanconisyndrome)–代谢性疾病(糖尿病,草酸中毒)–免疫球蛋白单克隆扩增(myeloma,Waldenström)–药物作用(氨基甙类抗生素)–中毒(金属中毒,氨基甙类)•白蛋白(30%)及其它小分子蛋白(小于67kDa)都将会在尿液中被找到。67kDa67kDa67kDa67kDa混合性损伤•混合性蛋白尿•肾脏病变同时或相继累及肾小球和肾小管时而产生的蛋白尿。•各组分所占比例因病变损害部位不同而不一致。67kDa67kDa尿液的收集和保存•尿液收集:-24小时尿-晨尿中段•要注意是否为间歇性蛋白尿•保存-新鲜尿液-4°C保存最多一周-注意防腐，避免反复冻融（导致IgG浓度降低）-检测前离心(10min3000rpm）尿蛋白检测初级分析是否有蛋白增加-直接进行总尿蛋白浓度测定进一步分析:•蛋白尿类型•本周氏蛋白类型•特异蛋白定量定量分析蛋白尿•筛查-溴酚蓝试纸条检测(150-200mg/L):蛋白尿阳性变蓝，本周氏蛋白时会产生假阴性•定量检测方法-比浊法（不建议使用）-建议采用比色法（焦性没食子酚红，考马斯蓝）尿中总蛋白的定量分析无法检测到低浓度的本周氏蛋白特异蛋白测定•免疫法定量测定肾小球性标志蛋白:Albumin,IgG,Transferrin肾小管性标志蛋白:b2microglobulin,RBP,a1microglobulin如果需要更多的特异蛋白信息，需要更多的测试尿蛋白电泳提供更全面的蛋白信息在HYDRAGEL5PROTEINURIE凝胶上主要的尿蛋白电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量67kDa)起源于肾小球的各类蛋白(分子量67kDa)白蛋白(分子量:67kDa)a1-微球蛋白(MW:33kDa)游离轻链(MW25kDa)转铁蛋白(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白(MW:12kDa)溶菌酶(MW:15kDa)视黄醇结合蛋白(MW:21kDa)游离轻链的二聚体(MW50kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白(MW:900kDa)注:(CystatinC),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C5PROTEINURIE14.3KDa26.6KDa150KDa67KDa肾小球性蛋白尿血清Glomerularproteins(67kDa)肾小球性蛋白肾小管性蛋白尿SerSerTubularproteins肾小管性蛋白(67kDa)临床病例2:Lightchainmyeloma轻链性骨髓瘤4:MacroscopicHematuria肉眼血尿MW5:OverloadProteinuriawithpolymerisedBJ本周氏蛋白多聚体非浓缩尿蛋白电泳的优点1.可以直观地反映出病人是肾小球受损还是肾小管受损，或者是小球小管均受损伤的混合型尿蛋白。2.操作简便、尿液无须浓缩，只需2个半小时即可出报告。3.对不愿意进行肾穿检查的病人,可作为替代实验。4.方法敏感，最小检出限度为15mg/L。5.能得到尿蛋白剖像的电泳谱，便于比较和保存。6.儿童尤以肾小球病变为主,直接检测24h尿蛋白。7.对临床不典型的患者及微量尿蛋白的患者的诊断及各种肾病在治疗过程中的动态分析具有很高的临床价值。本周氏Bence-Jones蛋白检测本周氏蛋白（Bence-JonesProteins,BJP)•HenryBenceJones于1844年在一个骨髓瘤患者尿中发现的一种具有特殊凝溶性质的蛋白•该种蛋白40－60℃发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀。后被证明是单克隆的免疫球蛋白轻链二聚体。•大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白50~60℃室温90~100℃本周氏蛋白浆细胞增生症影响血液中出现游离轻链尿液中出现起因结果骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.....肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病本周氏蛋白阳性患者•多表现为肾脏损害•极易误诊为慢性肾炎•轻链有3种形式出现在血清或尿中–正常的轻链过剩•慢性肝病、红斑狼疮等多克隆增殖性疾病–伴随轻链–单一轻链本周氏蛋白免疫固定电泳方法仪器：Sebia琼脂糖凝胶电泳仪试剂：本周氏蛋白电泳试剂方法：点样，电泳，加抗体反应，条带检测ELP泳道:固定液GAM泳道：抗IgG.A.M重链抗血清K泳道：抗轻链抗血清L泳道：抗轻链抗血清Kfree泳道：抗游离轻链抗血清Lfree泳道：抗游离轻链抗血清重链参考泳道复合轻链游离轻链免疫球蛋白•免疫球蛋白是机体的正常生理成分•多克隆•分类–重链：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE–轻链：κ、λ–10种类型抗复合轻链抗血清结合位置抗游离轻链抗血清结合位置，不能与完整抗体的轻链结合本周氏蛋白检测结果解析游离kappa复合kappa游离lambdaLambdaBenceJonesprotein(G,AorM)kappakappaBenceJones2differentlevelsofpolymerization1.BenceJonessuspected2.NoBenceJonessuspected3.BenceJonessuspected4.BencesJonessuspectedBenceJones?1.BenceJoneslambda(polymerized)2.NoBenceJones3.BenceJoneslambda4.BencesJoneskappa(polymerized)本周氏蛋白电泳检测对象•肾病•不明原因水肿•尿蛋白阳性•血清蛋白电泳提示“M蛋白”•尿SDS蛋白电泳提示“轻链”存在•骨髓瘤患者•其他淋巴系统恶性增殖性疾病–淋巴细胞白血病–浆细胞型白血病谢谢