常规病理组织处理

病理常规组织处理组织标本离体后，要经过固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等一系列的后续处理。组织处理的每一个步骤都非常重要。因为标本的取材，部位的选择等等，都或多或少地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最终的诊断是否合适组织结构的保存、有效成分的保留，取决于组织处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常的工作中不断积累熟练的技巧和经验。一.固定病理标本的制作和组织处理都必须先进行固定。如果固定不佳，制片的其它程序将非常困难，可以说没有很好的固定就没有很好的HE染色，就会造成诊断困难，甚至误诊，这足以证明固定的重要性概念：组织离体后，采用某些办法使其细胞内物质尽可能接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。（应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程）目的：防止组织细胞自溶和腐败，保持细胞内成分（蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类）与原有的结构与生活时相仿。方法：1.物理学方法：如低温冷冻，干冰（dryice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。2.化学方法：采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。注意：1.组织离体及时固定（大标本切开固定）2.组织块大小适宜（1.5×1.5×0.2厘米为宜）3.合理选择固定液（免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛；我病理科大标本一般选择中性缓冲甲醛，它可以兼顾常规染色和免疫组化。小标本选用AAF液）4.固定液的量为组织5倍以上（最少也要没过组织）5.固定时间得当：大标本（6-12H）小标本（3-6H），时间太短，影响组织固定的效果，对以后一系列的处理都有影响，切片质量难以保证。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性，影响组化。微小破碎组织，在包埋操作时易于识别操作，组织处理前可浸泡在1%伊红液中5-10分钟。伊红的粉红色在组织处理时可以保留，但是在随后的切片染色中可以洗去不影响正常的染色。常用固定液的介绍和配制1.10％中性缓冲福尔马林：甲醛100ml，无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）4.0g，蒸馏水900ml特点：渗透力强，收缩小，对抗原保存较好，此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。2.AAF液：95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。特点：此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。其他还有很多固定液，不一一介绍，有些液体混合后使用比单独使用效果更佳，作用互补，真正达到固定的目的。二.水洗1.固定后必须水洗（15-30min),流水冲洗最佳，特别是固定时间长的组织。2.水洗不彻底后果：福尔马林色素沉着、脱片、染色不鲜艳、免疫组化标记中抗原抗体结合力减弱等现象三.脱水概念：利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入。浓度与时间：脱水用的乙醇浓度一般从70％~75％开始，然后依次80％→95％→100％，即由低浓度逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很大关系、组织厚大，脱水时间要长些；而小薄的组织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些（如70％~80％），而在高浓度乙醇中要短些，这是因为高浓度的乙醇渗透力不强，延长脱水时间无益，相反高浓度乙醇易使组织收缩、变脆，致使以后切片和观察困难。脱水剂的种类有很多种，如乙醇、丙酮、甲醇、异丙基醇等。丙酮是透明无色易燃液体，易与水、乙醇和大多数有机溶液相混合。其脱水快，但渗透差，脱水时间长易引起组织扭曲和变形。丙酮用于脱水可以去除组织中的脂肪。另外，坚硬的组织也可以置入甘油乙醇混合液中浸泡处理。组织脱水不足的补救组织脱水不足常影响后继的透明与浸蜡,表现为含蜡组织块发软，制成蜡块后组织块与周边石蜡容易发生脱离，此种蜡块往往难以切出组织薄片或即使强行切出也会出现组织挤压、破碎，影响病理诊断。图1组织脱水不足所制蜡块,切片镜下观察,组织挤压、破碎,核染色不清图2补救处理后,组织平整、无破碎,核染色清晰把蜡块放入60度石蜡溶液中,使组织周围石蜡完全溶解,(1)保持组织块内石蜡成份处于溶融状态。同时,在75度水浴槽内先后放入盛有30ml丙酮的A、B两组烧杯(50ml容积),时间差约为5min,预热丙酮。(2)待A丙酮完全沸时,放入组织块,此时丙酮内逐渐有白色糊状石蜡沉淀出现,组织块有液泡冒出。(3)当B丙酮完全沸时,迅速将组织块从A丙酮换入其中,处理10min,此时丙酮内石蜡沉淀明显减少,组织块仅有少量或无液泡冒出。(4)取出组织块,立即投入75度石蜡溶液中,直至组织块无气泡冒出,约15min。(5)常规包埋、切片、HE染色。原理：本法以沸丙酮为介质。其原理为:(1)丙酮和石蜡不相溶，此特性保证了彼此单向置换，即以丙酮为溶液时，石蜡被置出；以石蜡为溶液时，丙酮被置出。(2)以75度作为脱蜡与浸蜡的适宜温度，远高于丙酮沸点(56-57)及石蜡溶点(58-60)，能使丙酮与石蜡有效而快速地进行单向置换。(3)丙酮作为一种快速脱水剂，目前主要用于快速石蜡切片的制备，适宜温度亦为75度。四.透明概念：透明是组织经脱水后，用能与脱水剂及石蜡混合的试剂，将脱水剂置换出来，使石蜡均匀渗透进去，有的透明剂可使组织呈透明状态，故称得。常用的透明剂为二甲苯，但它易使组织收缩、变脆，故透明时间不宜长二甲苯还能溶解脂肪，因此我们看到切片中的脂肪细胞胞浆是空泡状，是二甲苯脱脂所致。五.浸蜡概念：浸蜡是组织经透明后，置入熔化的石蜡中浸渗，一般为2-4小时。浸蜡时间过短，蜡没有完全渗入组织中，组织过软，切片困难；浸蜡时间过长，造成组织硬脆，切片也困难）目的：将石蜡均匀浸渗至组织中，使组织的硬度与石蜡的硬度相似，利于切片。浸蜡后的组织用包埋框将其包埋。包埋用蜡的熔点要与最后一次浸的石蜡熔点相一致，这样有利于切片。浸蜡温度应与石蜡熔点想对应，有条件的话（第一道石蜡可用48-50度熔点的石蜡），第二、三道石蜡用56-58度熔点的石蜡，温箱温度不宜高于62度。尽量不要在蜡里带入二甲苯。低熔点石蜡通常较柔软，高熔点石蜡通常比较坚硬，耐受切片。六.包埋包埋机一般由3个部分组成：自动流蜡器、冷台以及储备底座和组织包埋盒的热槽。石蜡经过喷嘴自动流入大小合适的包埋底座。组织在包埋底座中排列方向和位置，加盖塑料包埋盒，形成一个带有组织的平行的蜡块。注意：当组织包埋时，组织的方向对证明或显示组织的形态是一个重要的问题。组织的定向或定位不应该对组织切片有影响。错误的定向可能会导致所需组织成分的破坏或错误的诊断。大部分组织是平埋的，组织周边的包埋介质将对组织起到固定保护作用。以下组织需要特殊定向包埋：腔性结构如动脉、静脉、脉管需横切；皮肤、肠道、胆囊、膀胱和其它上皮类活检组织，应从底下开始切片，保证组织的上皮面最后切到，这样可以减少对上皮的挤压，损伤切片；肌肉活检：横向和长纵向切片；多块碎组织应一个接一个排列，保证组织结构在包埋时排列方向上的一致。过夜标本处理实施对许多科室来说，过夜处理是相对常用的一种处理模式。组织固定浸泡于10%福尔马林或AF液，梯度乙醇、二甲苯或二甲苯的替代物，以及石蜡浸透。使用自动组织处理机制定程序时应考虑影响处理程序的以下诸多因素：即实验室所需要的结束时间；使用的液体是否需要加热；是否启用加压，真空功能；组织标本数量的多少及体积的大小等1.固定4-6H2.水洗20-30min3.75%乙醇2h4.85%乙醇2h5.95%乙醇6.100%乙醇7.100%乙醇1.5h8.二甲苯30min9.二甲苯30min10.浸蜡30min11.浸蜡1.5h12.浸蜡1.5h组织干燥处理：组织处理的机器或设备发生故障时，导致组织在浸蜡之前发生干燥（干涸），组织可能会失去正常的形态，以下纠正处理的方法有助于帮助组织得到可以满足诊断需要的切片。组织干燥的修复方法：70%乙醇70ml，甘油30ml，二硫水杨酸钠1g，组织在该溶液停留数小时或过夜。组织处理重新从脱水液开始直至完成。组织切片时可能有些困难，为防止组织脱片可使用涂胶载玻片。常见问题及处理方法讨论：1.跳刀有波浪样或搓衣板样改变：出现跳刀有波浪样或搓衣板样改变的现象一般都是由于组织太硬或切片刀不够锋利造成的;也可能是由于切片机的零件松动造成的。因此,切片前要把切片机的有关螺旋拧紧,没有拧紧或包埋的蜡块过硬时就会出现跳刀,形成波浪样或搓衣板样改变的现象。同时,调整刀锋与蜡块的适宜角度,也可以防止跳刀的现象出现2.切片不全或有刮划痕迹：修片时深度不够、组织没有全部暴露于切面;切片的刮划痕迹是由于切片刀有缺口或者是包埋的组织有异物（线结）、钙化组织、骨组织及包埋石蜡有沙粒造成的。因此,修片时保证组织块全部暴露于切面;保证切片刀的锋利没刀口;同时在组织取材时去除手术异物和钙化组织;骨组织要完全脱钙。这样可以保证切片的完整和平整美观3.组织龟裂或有异物：组织龟裂是由于烤片时温度过高,切片急速受热切片过度伸张引起的;由于展片用的水有异物而污染切片。因此,摊片池的水要勤换,防止异物污染;同时,切片在空气中略干燥后烤片,烤箱温度为65度为宜,烤片时间15-30min为宜。对于脑组织切片必须待切片完全晾干后才能烤片。（本科室因为蜡块数多，时间紧，故有不规范的地方）4.脱蜡不干净,可见片状或点状发白石蜡切片必须经过脱蜡才能染色,脱蜡的好坏取决切片的温度和二甲苯的温度,烤片时必须将切片放置温箱加热到切片的石蜡融化后立即入二甲苯中脱蜡,或者将二甲苯稍加热脱蜡,这样可以脱蜡更加完全,更加彻底,然后经过梯度的泡洗,把二甲苯洗干净才能染色,否则,由于切片中石蜡或二甲苯的残留,染色剂与细胞不能有效接触而不着色,导致切片出现片状或点状发白5.切片过厚,细胞核模糊不清;由于切片刀不够锋利或者组织脱水不理想、组织块冰冻不够以及切片机准确度不高都会导致组织切片过厚,切片经染色后细胞重叠,细胞核模糊不清,影响镜下观察,容易造成误诊或漏诊,直接影响病理诊断的准确性。因此,技术员必须加强责任心,切片前选择锋利的切片刀,保持切片刀的锋利;勤换组织脱水的溶液,保持溶液的有效浓度和成分;切片机要勤保养,保持切片机的最佳状态;争取切出厚薄均匀的切片。6.组织切片裂隙“龟壳状”裂纹：用脱脂棉球蘸取足量的纯氨水，覆盖在细切后的组织面上约10s。退刀细切，取前1-3张经氨水处理再行切片，组织结构完好，“龟壳状”裂纹明显缩小，切片染色艳丽对比：