3730测序原理及基本峰图分析.

测序反应原理—双脱氧链末端终止法〔Sanger法【1977；FredSanger】）在包括DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）及4种ddNTP（ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP）的测序反应体系中，DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的DNA链。在链的延长过程中一旦加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。形成一系列具有相同5’-引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片段的混合物，通过毛细管电泳并经过分析从而获得模板DNA的核苷酸序列。“双脱氧末端终止”的含义PCR反应测序反应DNA聚合酶Taq酶测序酶引物一对单向底物dNTPdNTP+ddNTP*模板量少，质量要求低质量要求高产物等长的DNA片段相差一个碱基的一系列片段荧光标记无bigdyeV3.1测序产物指数扩增线性扩增测序反应与PCR反应的比较正常峰图1问题峰图2基本峰图分析正常测序结果长片段PCR——峰图信号图•短片段PCR——峰图--信号图PCR终止PCR终止峰终止峰后的噪音峰PCR终止峰噪音峰一、插入或缺失特征：从模板的插入或缺失位置开始出现双峰。插入位点二、结构PolyA/T一般会导致后续出现重叠峰Poly在序列的前端对信号影响较小PolyG/C很容易导致信号中断和信号衰减——————————————局部高GC一般会导致信号中断或乱峰Poly-G也是高GC的一种高GC含量导致信号衰减三、峰图移码1、引物问题：（1）新引物：合成时部分引物多了一个碱基或者少了一个碱基（2）引物降解2、结构导致移码（POLY结构，重复序列）3、插入突变或缺失突变导致移码（部分突变）缺失突变导致移码引物问题引起的移码一般从峰图起始端就开始出现，结构引发的移码是在结构之后才开始出现。四、模板不纯1、PCR有两套模板(非特异性条带)2、盐离子等杂质干扰或两套模板大小相近会产生自始至终的双峰。1、干扰峰（染料峰）2、引物二聚体峰3、宽峰，飘峰4、钉子峰5、模板量高染料峰固定出现在70bp和110bp处无信号峰型无引物结合位点或没加模板引物二聚体解决方案：重跑或重测可以解决但要注意是否是毛细管寿命问题钉子峰产生的原因：毛细管内有气泡，灰尘，和尿素结晶等。反射激光信号很高，且是全波长的，所以四色荧光并存。测序产物降解峰特征：在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。（1）Chromas（2）SequenceScannerv1.0（3）SequencingAnalysis5.2优点：简单方便，可用于直观的查看峰图序列。有查找以及互补反转功能。缺点：不能查看原始信号优点1：操作简单，可以整版查看峰图质量，可显示原始信号优点2：软件对峰图质量有初步判断（tracescore），并用颜色区分等级。功能大致与sequencescanner相同，多了重新分析的功能，可以利用这个功能对序列长度进行批量修改，也可以对下机后因信号转换产生的问题峰图进行重新分析。