酶联免疫吸附试验的影响因素

酶联免疫吸附试验的影响因素检验科实验过程中的影响因素终止与读数结果的判读试剂加样温育样本洗板显色一、标本排泄物血清唾液尿液、粪便分泌物体液血清标本脂血标本溶血标本标本的保存标本的离心采血试管采血试管1.使用非抗凝标本（血清）；肝素抗凝血浆会增加OD值;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA检测系统中辣根过氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃试管或真空采血管.标本采集后，应先将标本37°放置30-60分钟后采用3000r/min离心15-20分钟，取上清液加样。标本的离心标本的离心强行离心分离血清，会使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成假阳（阴）性结果。标本的保存1.一周----2～4℃保存；2.超过一周----建议-20℃保存。3.冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓缩而分布不均，加样前应充分混匀。标本的保存4.混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。5.作多次检测，宜少量分装冰存;6.血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细菌污染。避免细菌污染A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性的HRP会产生假阳性；B.细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶酶等蛋白水解酶）；C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。溶血标本1.ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或抗体；2.红细胞破坏后可释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白；3.残留的过氧化物酶催化底物产生非特性显色导致结果假阳性。脂血标本1.脂质小粒粘附在反应孔内壁；2.非离子型洗涤剂很难洗掉反应板上干扰性物质的非特异性吸附，引起吸光度A值升高，易造成假阳性结果。餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离心速度不合适等，都可使分离的血清标本中残留着大量的脂质小粒。二、试剂1.试剂盒保存于2-8℃2.使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡15-30分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。3.观察外包装和内组份有无漏液。三、加样仔细注意加样全部过程移液器的使用及时放入孵育箱标本较多时，请分批操作试剂的滴加加样过程应注意：A.加样不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可溅出；D.避免产生气泡；E.尽可能使用同一加样器，装紧枪头，加样后充分混匀。试剂的滴加从滴瓶中滴加，应注意滴加的角度和速度。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。移液器的使用移液的方法及注意事项枪头的装配量程的调节量程的调节1.从大体积调为小体积2.从小体积调为大体积在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪枪头（吸液嘴）的装配使劲地在枪头盒子上敲几下——错误将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合——正确枪头卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。移液的方法•前进移液法•反向移液法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。•重复操作移液法适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。•全血移液法移液的注意事项1.吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下1厘米。注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。移液的注意事项2.设定加样体积，不能大于加样枪标定的移液范围3.加样吸嘴的洁净和装配4.吸取液体和排出液体动作都一定要慢。移液的注意事项5.加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）6.不要用大量程的加样枪移取小体积的液体，以免影响准确度。移液的注意事项7.如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。8.表面清洁：用10%的次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。9.微量加样枪必须按要求定期进行校准。四、温育1.抗原抗体反应必须在一定的温度条件下反应一定的时间。2.温育所需时间与温度成反比。3.最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。实际操作中应注意：温育温度的选择足够的反应时间“边缘效应”的排除温育温度的选择1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间；2.在临床实验室中，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。“边缘效应”的排除1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深;2.有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，应尽量采用水浴。温育中让微孔板浮于水面上（浸入1/3），或将浸透水的沙布放入一大饭盒中形成湿盒，然后放于温箱中，这样可使微孔板板孔底部直接与37℃水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应溶液的温度迅速与温室平衡。五、洗板血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性。洗板的注意事项1.要有适当的浸泡时间（30-60秒）。2.洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul。3.洗液应调至适当的注出量，每孔应在350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。4.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不要私自增加或减少洗板次数。5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH值为7.4±0.2，水质宜新鲜，长菌或有沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。6.由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成结晶，配制洗液时应完全溶解。7.稀释好的洗液4℃下可保存3—5天。8.洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好的干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，避免交叉污染。9.操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清洗几遍后关机。10.每周要进行保养清洗。六、显色注意事项：1.检查底物溶液的有效性；2.试剂显色时先加A液，后加B液，二者不要颠倒。3.前后加入的间隔时间不超过10分钟。4.若把A液和B液先混合，再加样显色，需要求二者等体积混合。5.A、B液应避免接触污染物。6.不同厂家显色液不得混用。七、终止和读数肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测结果，以保证结果一致性。注意事项1、酶标仪的波长是否合适或滤光片是否正确。2、单波长或双波长比色选择的问题。ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色3、加完终止液后30分钟内读取数据。4、保证酶标板的底部是清洁干燥的。双波长比色？双波长比色测定能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响，一般不必设空白孔。ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性；在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。八、结果的判读灰区的定义灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cutoff值正负20%这个范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。灰区的处理1.灰区是客观存在的，没有不存在灰区的试剂，我们只是尽量减少灰区的出现比例。2.减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干净。3.严格控制温育时间。其他的影响1.干扰物质的影响常见的干扰物质如类风湿因子、甲胎蛋白、某些自身抗体等，都会使结果造成假阳性。2.药物的影响如高效价的乙肝免疫球蛋白等。思考题•为什么多次实验重复性差（相同样本两次测定结果不一致）？多次实验重复性差（相同样本两次测定结果不一致）A.血清标本未完全凝固即加入；B.不同批号试剂盒中组分混用；C.加样；D.温育时间、洗板、显色时间不一致；E.孔内有污染物；F.显色液滴加出现问题；G.酶标仪滤光片错误,测量波长不一致.