色谱法导论(20110408)

第十二章色谱法导论导学本章是色谱学的核心内容。通过对本章的学习，在了解色谱发展历史的基础上，深刻理解色谱法的概念、分类及特点；掌握色谱法的分离原理和分配系数及分配比的概念；通过对色谱图常用术语的了解和运用，重点掌握保留值及其相关内容；色谱理论既是对色谱现象的概括，也是对色谱发展的指导，塔板理论和速率理论非常重要，尤其是对塔板高度与载气线速度的关系式应充分理解清楚；实际工作中的分离问题与分离度密不可分，所归纳出的分离度公式是色谱法中最重要的公式，并根据它可以通过改变一些参数来控制分离度；了解色谱定性的一些基本方法，主要掌握定量分析的相关方法，特别是定量计算方法。第十二章色谱法导论学习大纲§12-1概述§12-2色谱分离原理§12-3色谱图及常用术语§12-4色谱法基本理论§12-5分离度§12-6色谱定性和定量分析§12-1概述美国气相色谱仪HP高压液相色谱仪国产气相色谱仪一、色谱法（chromatography）俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图：色谱法是一种分离技术。试样混合物的分离过程是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法简史俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素1903年发表文章：Onanewcategoryofadsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis1906年Tswett创立“chromatography”——“色谱法”新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管1930年R.Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素1935年AdamsandHolmes发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年Izmailov发明薄层色谱1941年Martin&Synge发明了液-液分配色谱1944年Consden,Gordon&Martin发明纸色谱1952年Martin&Synge发明气-液色谱1953年Janak发明气-固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin&Golay发明毛细管色谱1959年Porath&Flodin发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善经典：分离过程和其含量测定过程是离线的，即不能连续进行。现代：分离过程和其含量测定过程是在线的，即能连续进行经典色谱法：将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，用适宜的方法进行分析。现代色谱法：当一个两组分（A和B）的混合物样品在时间t1从柱头加入，随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组分先后流出柱子而进入检测器，从而使各组分浓度转变成电信号后在荧光屏上显示出来。根据峰的位置（出峰时间t）——定性根据峰的面积A（或峰高h）——定量二、色谱法的分类1、按流动相和固定相所处的状态分类流动相气体液体方法名称气相色谱（GC）液相色谱（LC）固定相固体吸附剂液体固体吸附剂液体分离依据吸附分配吸附分配方法名称气—固色谱（GSC）气—液色谱（GLC）气—液分配谱（GLPC）液—固色谱（LSC）液—液色谱（LLC）超临界流体色谱法(SFC)用超临界状态的流体作流动相的色谱法。超临界状态的流体不是一般的气体或流体,而是临界压力和临界温度以上高度压缩的气体,其密度比一般气体大得多而与液体相似,故又称为“高密度气相色谱法”2、按固定相的固定方式分类()()()???作固定相将吸附剂粉制成成薄层薄层色谱法定相用滤纸上的水分子作固纸色谱法固定相装在色谱柱中柱色谱法3、按分离过程的机制分类()()()()大小分子的排阻作用利用多孔性物质对不同排阻色谱法利用离子交换原理离子交换色谱法分离有不同分配系数来进行利用不同组分在两相中分配色谱法差异进行分离组分的物理吸附性能的利用吸附剂表面对不同吸附色谱法三、色谱法的特点和应用1、分离效能高2、灵敏度高3、分析速度快4、应用范围广5、色谱法的缺点是对未知物的定性分析比较困难(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。(4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。★应用范围广§12-2色谱分离原理一、色谱分离原理色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。色谱分离过程的两大特点：第一、不同组分在通过色谱柱时移动的速度不等，它提供了实现分离的可能性。第二、各组分分子沿柱子进行扩散分布。二、分配系数和分配比分配平衡可用分配系数或分配比来表征。定义：组分在固定相和流动相之间发生的吸附与脱附或者溶解与挥发的过程叫分配过程。1、分配系数K分配系数K又称为平衡常数，是指在一定的温度和压力下组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度Cs与在流动相中的浓度Cm之比，即mSCCKK↑溶解度或吸附能力↑，组分在固定相中的量↑，在流动相中的量↓。K↑进入固定相的组分↑，组分在固定相中滞留的时间越长，流出色谱柱所需的时间也就越长。K是一个无因次量，由组分及固定液的热力学性质决定的，只随柱温和柱压而变化，与色谱柱中气相和液相的体积无关。如果两个组分的分配系数相同，则它们的色谱峰完全重合；分配系数相差越大，相应的色谱峰相距越远，分离越好。分配系数K的讨论K组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。2、分配比k’分配比k’又称容量因子或容量比，是在一定温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的质量p和在流动相中的质量q之比，即qpk'（1）分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。（2）分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。（3）分配比可以由实验测得。分配比k’的大小由下式计算：k’=tR`/t03、分配系数与分配比的关系'kqVpVVqVpCCKSmmSmSSmVV称为相比。Vm——为柱内流动相的体积，也称为柱的死体积：包括固定相颗粒之间和颗粒内部空隙中的流动相体积；Vs——为固定相的体积，它指真正参与分配的那部分体积：若固定相是吸附剂、固定液、离子交换剂或凝胶，则分别指吸附表面积、固定液体积、离子交换剂交换容量或凝胶孔容。4、基本保留方程基本保留方程可表示为：tR=t0(1+k)若载气流量F0恒定，也可用保留体积表示，则VR=Vm+KVs这就是色谱基本保留方程。上式说明，色谱柱确定后，Vm和Vs即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。§12-3色谱图及常用术语试样各组分经色谱柱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号。电信号强度随时间变化的曲线，称为流出曲线，也叫色谱图。一、基线当没有待测组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线。稳定的基线是一条直线。二、峰高从色谱峰顶点到基线的距离叫峰高。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。噪音：使基线发生细小的波动的现象。三、区域宽度区域宽度即色谱峰的宽度，可用三种方法表示：1、峰底宽度Wb3、标准偏差σ2、半峰宽1/2W1、峰底宽度Wb2、半峰宽2/1W3、标准偏差σ拐点间距离的一半，即图中1/2EF。峰底宽Wb=4σ，半峰宽=2.354σ。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：201exp[()]22rCttC式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。不对称因子：在实际的色谱过程中，很少符合高斯分布，而是具有一定的不对称性。可以定义一个不对称因子As来定量地表示色谱峰的不对称程度。拖尾峰：当As大于1时，色谱峰的形状是前半部分信号增加快，后半部分信号减少慢。引起峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在吸附作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。伸舌峰：当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。色谱流出曲线的意义色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。四、保留值保留值用来表示色谱峰在色谱图中的位置。保留值是试样中各组分在色谱柱中滞留时间（retentiontime）的数值，反映了组分分子与固定相分子间作用力的大小。保留值通常用时间、距离或用将组分带出色谱柱所需要的流动相体积来表示。保留值是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。因此，在一定色谱条件下保留值是特征的，可作为色谱定性的参数。（一）保留值的定义1、保留时间Rt（retentiontime）2、死时间Mt（deadtime）3、调整保留时间Rt（adjustedretentiontime）4、保留体积RV5、死体积MV6、调整保留体积RV从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。1、保留时间（retentiontime）Rt2、死时间（deadtime）Mt不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值所需要的时间称为死时间。死时间实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间，或者组分在流动相中所消耗的时间。因此，也叫流动相保留时间。对于同一试样所有组分组死时间都是相同的。MtuLtM式中为柱长（cm）；为流动相平均线速度（cm/s）。uL3、调整保留时间（adjustedretentiontime）组分的保留时间与死时间之差值，即RtMRRtttRt实际上就是组分被固定相滞留的总时间。4、保留体积从进样开始到色谱峰最大值出现时所通过的流动相的体积，其单位为mL。计算公式为：RVRcRtFV式中为流动相平均体积流速，因为液体可以认为是不可压缩的，所以在液相色谱中，即为实测值；而在气相色谱中，由于气体可以压缩，因此必须根据色谱柱的工作状态，对实验值进行校正，才能得。cFcFcF5、死体积不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积，可由死时间确定：MVMcMtFV死体积本意是指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积，也即色谱柱内流动相的体积。但在实际测量时，它包括了柱外死体积（色谱仪中的管路和连接头间的空间以及进样系统和检测器的空间）。当柱外体积很小时，可以忽略不计。6、调整保留体积保留体积减去死体积，叫做调整保留体积，即组分停留在固定相时所消耗的流动相体积。RVcRMRRFtVVV（二）保留值与平衡常数K的关系调整保留体积与平衡常数K成正比。推导依据：当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分恰好有一半的量洗脱在体积的流动相中刚好流出柱子，其余一半则仍留在柱内，即留在柱内的流动相（体积为Vm）与固定相（体积为Vs）中。RVsRKVV（三）保留值与容量因子的关系由容量因子与平衡常数的关系可得：MMRMRMRMMRtttttVVVVVk可见，容量因子是调整保留时间与死时间之比tR’=k’t0=Kt0Vs/Vm在