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药学分子生物学张徐江苏大学医学院分子生物学及检验教研室xuzhang@ujs.edu.cnRNA干扰(RNAinterference,RNAi)在生物体细胞内,双链RNA诱导同源mRNA特异性降解,导致基因表达抑制,又称转录后基因沉默。RNA干扰作用机制:(1)siRNA形成:dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA(2)RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)形成(3)RISC活化:siRNA解旋成为单链,无活性的RISC转变成活性形式(包含siRNA反义链)(4)诱导靶mRNA降解:在siRNA反义链引导下,RISC识别并切割与siRNA反义链互补的靶mRNA;(5)dsRNA的再生成siRNA(小干扰RNA):21-23nt,由长dsRNA裂解而成的小片段,可诱导mRNA降解。siRNA主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。细胞中存在两种RNA干扰现象:miRNA(微小RNA):由miRNA前体剪切而成,可抑制mRNA翻译。miRNA主要参与内源性基因的表达调节。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)siRNA(小干扰RNA)miRNA(微小RNA)来源siRNA是外源性的,是RNA干扰的中间产物miRNA是内源的是生物体固有结构siRNA是双链RNAmiRNA是单链RNADicer酶加工过程对称地来源于双链RNA不对称加工,仅剪切miRNA的侧臂作用位置siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶标基因3′端非翻译区(3’-UTR)作用方式siRNA一般导致靶mRNA的降解,即为转录水平后调控。miRNA可抑制靶mRNA的翻译,也可以导致靶mRNA降解,即在转录后水平和翻译水平起作用作用阶段siRNA不参与生物生长,主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达RNA干扰技术的应用基因治疗(基因失活性治疗)(1)病毒感染性疾病通过RNAi抑制RNA病毒复制基因功能研究(功能失活策略)(2)基因过表达引起的疾病(如肿瘤)siRNA药物RNA干扰技术的实施策略体外合成siRNA、体内转录shRNA基因打靶(genetargeting)利用同源重组原理对细胞特定内源基因进行改造的技术。基因敲除(geneknockout):宿主基因组中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代,从而使靶基因失活。基因敲入(geneknockin):外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,从而在细胞内获得表达。基因打靶(genetargeting)基因敲除小鼠的产生1.体外构建基因敲除载体:靶基因同源DNA序列+选择性标记基因2.将基因敲除载体导入ES细胞:显微注射法、电穿孔法等3.筛选、鉴定发生了同源重组的ES细胞:标记筛选法、分子鉴定法4.将ES细胞导入胚胎,胚胎植入假孕雌鼠的子宫5.小鼠交配传代获得特定的纯合基因型子代小鼠Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠(WT)出现明显体重增加现象REGγ基因敲除鼠(下图)出现脊椎弯曲等早衰现象Gab1基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺陷(图示上半部分),主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的信号调控通路出现障碍而引起的(图示下半部分)。酪氨酸酶基因敲除后,本来是黑色的小猪,变成了白色,表现出典型的白化病特征。基因编辑(geneediting)对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。CRISPR/Cas系统:由CRISPR基因座与其串联的Cas基因组成,通过序列特异的RNA介导,切割降解DNA。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/Cas9CRISPR:成簇规律间隔性短回文重复序列Cas:CRISPR相关基因RNA干扰(RNAi)siRNA、miRNARNA干扰技术策略、应用基因敲除基因编辑常用分子生物学技术:RNA干扰、基因敲除小结作业比较RNA干扰与基因敲除的异同点,简述它们在药学中的应用。第十章外源基因表达与基因工程药物基因工程药物重组人胰岛素重组人白细胞介素-2重组人干扰素外源基因表达:利用分子生物学技术,在体外将外源基因重组至合适表达载体上,通过有关技术将其导入宿主细胞,借助宿主细胞内系统,合成具有生物活性的蛋白质。基因工程技术:基因克隆(上游技术)+外源基因表达(下游技术)基因克隆上世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术,也称分子克隆。通过相应技术手段,将目的基因导入宿主细胞,并在宿主细胞内大量复制。按步骤可概括为∶分、切、连、转、筛。切连转筛获取目的基因和载体目的基因和载体连接重组DNA导入受体细胞重组体的筛选与鉴定分限制酶切割基因克隆一、目的DNA的分离获取(分)二、载体的选择与限制酶切(切)三、目的DNA与载体连接(连)四、重组DNA转入受体细胞(转)五、重组体的筛选与鉴定(筛)基因克隆五个基本部分(一)目的基因的获得1、化学合成适用于合成分子量较小的目的基因2、PCR及RT-PCR合成序列已知的基因3、基因组文库与cDNA文库包含全面的基因和mRNA信息适用于合成分子量较小的目的基因(100bp以内),如:人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列,可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列,再用DNA合成仪人工合成目的基因。1、化学合成DNA片段2、PCR与RT-PCR扩增DNA模板上游引物下游引物PCR扩增目的片段mRNA逆转录cDNA上游引物下游引物PCR扩增目的片段基因组文库3、基因组文库与cDNA文库cDNA文库3、基因组文库与cDNA文库基因组文库(genomiclibrary,G-文库)是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。cDNA文库(cDNAlibrary,C-文库)以细胞全部mRNA经逆转录,制备出全套的cDNA克隆集合。如何从文库中获取目的基因?文库查询(screening):采用探针与文库中的重组DNA进行杂交反应文库重组DNA探针杂交信号电泳后杂交反应检测基因组文库特点:含有基因组内全部基因片段(99%),是一个贮存基因组全部序列的信息库(含内含子等);真核细胞G-文库中含有较多的重复序列与内含子,一个单拷贝基因只占基因组的10-7~10-5;具有种属特异性,但无组织特异性;cDNA文库特点:cDNA文库中,平均一个目的基因所对应的mRNA占总mRNA的10-4~10-3,相比之下后者比前者在含量上提高2~3个数量级,便于提取目的基因。体现实时表达的信息,不包含全部遗传信息。既有种属特异性,又有组织特异性;载体(vector):携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。2.按功能克隆载体表达载体1.按来源质粒噬菌体病毒人工染色体(二)目的基因与表达载体的重组病毒(virus)质粒(plasmid)噬菌体(phage)载体按功能分类:克隆载体(cloningvector)表达载体(expressionvector)克隆载体基本组成:①复制原点;②限制酶切位点;③带有筛选标记;表达载体还具有:④表达调控元件多克隆位点(multiplecloningsites,MCS):一段人工合成的DNA序列,含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列,以便不同来源的外源DNA片段插入载体。1.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的一类核酸内切酶,为原核生物所特有。分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因工程技术中常用的是Ⅱ类(分子剪刀),识别与切割位点序列特异,在识别序列内切割DNA重组工具酶限制性核酸内切酶的发现1970年,第一个限制性核酸内切酶定点剪切DNA操作DNA1978年,获诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶——用于切割DNAⅡ类酶识别序列(4~6个碱基对):——回文结构(palindrome)断裂磷酸二酯键,形成平端或粘端切口平末端端或粘性末端(Cohesive/Stickyend)2.DNA连接酶一种封闭DNA链上缺口的酶,催化DNA链相邻的3’羟基与5’磷酸基团形成磷酸二酯键。基因工程“缝纫针”基因重组(generecombination)目的基因与载体分别经DNA限制性核酸内切酶切割,再通过DNA连接酶,将目的基因与载体以3’,5’-磷酸二酯键连接形成重组子(重组基因),也称DNA重组。DNA重组1972年,世界上第一个重组DNA分子诞生PaulBerg猿猴病毒DNA噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶重组DNA分子1980年,获诺贝尔化学奖DNA重组策略同一种限制酶酶切(一)粘性末端连接缺点:载体自身环化;连接方向错误;碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团。主要用途有:防止载体DNA自身环化,提高重组效率。5-pCpGpC┅┅-OH3碱性磷酸酶5-CpGpC┅┅-OH35-p3-HO5-HO3-HO碱性磷酸酶:防止载体的自身环化3HO-G━━━━━CTTAA-p55p-AATTC━━━━━G-OH33HO-G━━━━━CTTAA-p55p-AATTC━━━━━G-OH3质粒目的基因━━━━━━━━━━━━━━━━目的基因和载体连接EcoRⅠEcoRⅠ碱性磷酸酶3HO-G━━━━━CTTAA-OH55HO-AATTC━━━━━G-OH3退火DNA连接酶3HO-G━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p55OH–AATTC━━━━GAATTC━━━━━G-OH3EcoRⅠ:识别GAATTC序列(二)定向克隆使目的基因按正确方向插入载体中的方法。定向克隆的两种连接方式:粘-粘连接粘-平连接本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点(三)人工接头(linker)化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。可在PCR扩增目的基因时人为添加含有限制酶切位点的序列到引物的5’末端(四)同聚物加尾连接本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点(五)PCR引入粘性末端后连接PCR扩增限制性酶切引物1引物2限制性酶切作用位点1限制性酶切作用位点2与经相应的限制性酶切的载体连接在PCR扩增目的基因时将限制性酶切位点人为添加到引物的5’末端。经PCR扩增获得带有限制性酶切位点的目的片段,用相应限制性酶切割后,产生粘性末端,随后与载体(也经相应的限制性酶切割)进行粘性末端连接。
本文标题:第十一章:外源基因表达与基因工程药物
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