您好,欢迎访问三七文档
真核基因表达调控Regulationofeukaryoticgeneexpression表型(Phenotype)与基因型(Genotype)基因表达(geneexpression)Genomics--DNA--sequencing3×109bp扫描分析结果FunctionalgenomicscDNA芯片技术从组织或细胞中抽提mRNART-PCR产生荧光标记的cDNA与芯片杂交孵育cDNAchipProteomics--protein---2D-PAGEMass-SpectrometrySDS-PAGEPAGE(Polyacrylamidegelelectrophoresis):根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。SDS-PAGE二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分离)。2D-PAGE2Dimensional-PAGE2D-PAGEProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications从50-200mg组织或细胞、体液中抽提蛋白质↓Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品↓洗去多余的标记分子↓与芯片杂交孵育↓扫描分析结果抗体芯片技术抗体芯片Antibodychip微型化、集成化、高通量化表观遗传学(epigenetics)表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰。三个层面调控基因表达:DNA修饰:DNA共价结合1个修饰基团,使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态。蛋白质修饰:通过对特殊蛋白的修饰或改变蛋白的构像实现对基因转录的调控。非编码RNA调控:通过某些机制实现实现对基因表达的转录后调控,如RNA干扰。Epigenome:基因组规模的表观遗传修饰称为‘表观基因组’。ChIP-on-chipChIP-on-chip(alsoknownasChIP-chip)isatechniquethatcombineschromatinimmunoprecipation(ChIP)withmicro-arraytechnology(chip).1.Proteinofinterest(POI)iscross-linkedwiththeDNAsite.2.ThecellsarelysedandtheDNAisshearedbysonication.3.OnlythesecomplexesarefilteredoutofthesetofDNAfragments,usinganantibodyspecifictothePOI.4.Thecross-linkingofPOI-DNAcomplexesisreversed(usuallybyheating)andtheDNAstrandsarepurified.5.Afteranamplificationanddenaturationstep,thesingle-strandedDNAfragmentsarelabeledwithafluorescenttagsuchasCy5orAlexa647.6.ThefragmentsarepouredoverthesurfaceoftheDNAmicroarray,whichisspottedwithshort,single-strandedsequencesthatcoverthegenomicportionofinterest.Last,duringthedry-labportionofthecycle,gathereddataareanalyzedtoeitheranswertheinitialquestionorleadtonewquestionssothatthecyclecanstartagain.同一个体的肌细胞和白细胞的基因型是否一致?基因表达调控Regulationofgeneexpression不同发育阶段、不同的微环境、不同的功能状态下,选择性、程序性地在特定细胞表达特定数量的特定基因。一、原核基因表达调控Regulationofprokaryoticgeneexpression1961年,Jacob和Monod提出。操纵子(operon):由功能相关的一组结构基因(structuralgenes)串联在一起,包括上游的调控区共同构成。调控区I:inhibitorygene→阻遏蛋白P:promotersequence→RNA聚合酶结合位点O:operatorsequence→阻遏蛋白结合位点结构基因LacZ:β-galactosidase→β-半乳糖苷酶LacY:β-galactosidepermease→β-半乳糖苷透过酶LacA:thiogalactosidetranscetylase→硫代半乳糖苷转乙酰基酶1.乳糖操纵子CAP:(catabolitegeneactivatorprotein)分解代谢物基因激活蛋白CRP:(cAMPreceptorprotein)cAMP受体蛋白分子结构含DNA结合区和cAMP结合位点CAP结合位点:位于启动子上游TGTGA或TCACTcAMP-CAP导致CAP构像发生变化,可与DNA分子特定的CAP结合位点结合,激活基因转录。细胞内葡萄糖浓度↑cAMP浓度↓细胞内葡萄糖浓度↓cAMP浓度↑cAMP+CAP→复合物,结合于CAP结合位点,激活基因转录,增加酶产量。乳糖操纵子的作用机制LacZ在基因工程中的应用质粒(plasmid):细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子,能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术中重要的工具。Multicloningsite限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。IPTG:异丙基硫代半乳糖苷,不参加代谢X-Gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷二、真核基因表达调控Regulationofeukaryoticgeneexpression一个多水平的复杂过程。1.转录前水平2.转录水平3.转录后水平4.翻译水平5.翻译后水平真核生物基因表达调控(一)真核细胞基因组的特点1.DNA量大:与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内。2.断裂基因(splitgene)外显子(exon):为蛋白质氨基酸编码的DNA序列。内含子(intron):插入到编码序列之间的非编码序列。真核生物的细胞平均每个基因含8个内含子。前体分子比成熟mRNA大4~10倍。内含子功能:(1)含调控序列,参与基因表达。(2)不同的剪接,产生不同的产物。3.重复序列在基因组中多次反复出现的DNA序列,按其出现的频率可分为低度、中度(103-104)和高度(106)重复序列。出现原因:(1)基因的多拷贝。(2)与染色质的构像、着丝点形成有关。(3)参与表达调控,染色质DNA的“区间性”。微卫星(microsatellite):遍布于人类基因组的短小重复序列,每一重复序列为1bp~6bp,重复次数不超过60次,片段长度小于350bp。微卫星不稳定性的研究方法PCR变性PAGE银染与正常组织相比较,若某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上,记为杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH);若等位基因条带增多和大小有改变则记为MI。LOHMI4.不存在操纵子结构多个基因协调表达。(二)转录前水平的表达调控发生在基因组水平上的基因结构的改变。1.基因丢失2.基因扩增3.基因重排4.甲基化修饰5.染色质结构1.基因丢失体细胞分化过程中,必须将某些基因永久性关闭。最简单有效的方式---将这些基因丢失。将要分化为生殖细胞的细胞则一直保留着整套基因组。2.基因扩增发育分化、环境条件的改变,对某些基因产物的需要量急剧增加--增加该基因的拷贝数。非洲爪蟾卵母细胞(200万个)中rRNA基因(rDNA)的拷贝数为体细胞(500个)的4000倍。扩增→1012核糖体。无扩增→500年。多数人认为是基因反复复制的结果。Myc基因扩增形成均染区(黄色)的核型不适当的基因扩增,可导致肿瘤的发生。基因组扩增:肝细胞的基因组是通过多倍体扩增的。成人肝细胞4倍体占60%。这些多倍体细胞的代谢极其活跃。多倍体可能有益于连续产生大量的蛋白质和酶。3.基因重排某些基因片段改变原来存在的顺序重新排列组合。如:Ig由2条相同的轻链(λ或κ)和2条相同的重链(H)组成。编码多肽链基因符号(人)基因定位(染色体)人小鼠κ轻链IGK2p116λ轻链IGL22q1116H重链IGH14q32.312Ig基因定位Ig重链基因是由V、D、J和C四种不同基因片段所组成。1.Ig重链可变区(V区)基因重链可变区基因是由V(variable,200种)、D(diversity,10种)和J(joing,4种)三种基因片段经重排后所形成。2.Ig重链恒定区(C区)基因重链恒定区基因由多个外显子组成,位于J基因片段的下游。H基因随机取1个V、J、C连接形成VDJ,其mRNA通过与不同的C基因(alternativeRNAsplicing)拼接形成IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。κ基因由可变区(V,200种)、连接区(J,4种)和不变区(C)3部分组成。细胞分化时,每个细胞中的κ基因发生重排,随机取1个V、J、C基因连接形成1个完整的轻链基因,将其他的V、J基因切除。κ基因重排产生200×4=800种不同轻链H基因重排产生200×10×4=8000种VDJ抗体:800×8000=64000004.甲基化修饰脊椎动物中,DNA上特定的CpG序列处C可发生甲基化修饰(5mC)。约70%的mCpG存在于CpG。DNMT1SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧啶结构基因的5’端调控区域,CpG常常以成簇串联形式存在,此区域称CpG岛(CpGisland),其大小为500~1000bp,约56%的编码基因含该结构。CpG岛的5mC阻碍转录因子复合体与DNA的结合,抑制基因的转录。DNA甲基化对转录的抑制主要决定于甲基化CpG的密度和启动子强度两个因素。转录活跃的基因是低甲基化或不甲基化,而不表达基因则高度甲基化。(红系细胞)低甲基化珠蛋白基因(不表达珠蛋白细胞)高甲基化生殖细胞中,全部组织特异性的基因均不表达,且被甲基化。甲基化修饰与肿瘤发生5.染色质结构DNA+HP+NHP+RNA=Chromosome组蛋白(histoneprotein,HP):含碱性氨基酸25%。与DNA有很高的亲和力。细胞内大量存在。(6×107个分子/细胞)进化上较保守。与核小体的稳定和高级结构的组装有关。保护DNA免受损伤,维持基因组的稳定性。与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合,从而遮蔽了DNA分子,妨碍了转录HP修饰乙酰化:一般与活化的染色质构型相关联。多发生在H3、H4的Lys残基。甲基化:可与基因抑制有关,也可与基因激活有关。多发生在H3、H4的Lys和Arg残基。磷酸化:一般与基因激活有关。发生在Ser残基。泛素化:启动基因转录。一般是C端Lys修饰。Histonecode非组蛋白(non-histoneprotein,NHP):多为中性或酸性蛋白。种类较多,数量少。(<10000个分子/细胞)分子量一般比组
本文标题:基因表达
链接地址:https://www.777doc.com/doc-4053343 .html