从菠菜中提取草酸及其含量的测定

2009,Vol.30,No.16食品科学※分析检测216曾芳，刘忠珍，许桂芝，王荣辉，欧俊(广东省农业科学院土壤肥料研究所，广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室，广东广州510640)采用离子色谱法研究不同温度和盐酸加入量对菠菜、苋菜、芫荽、韭菜4种蔬菜水溶性草酸和总草酸提取测定的影响。水溶性草酸用不同温度的水溶液提取，总草酸用不同量的0.5mol/LHCl浸提，离心稀释过滤后上机测定。菠菜和苋菜的水溶性草酸随提取温度的升高而增大，总草酸含量在0.5～2ml0.5mol/LHCl范围内随盐酸加入量的增加而增大；而芫荽和韭菜的水溶性草酸和总草酸含量随提取温度和盐酸加入量的变化不大。采用2ml0.5mol/LHCl浸提总草酸，用沸水浴20min浸提水溶性草酸，适用于不同类型蔬菜样品草酸的提取测定。4种蔬菜中草酸的加标回收率在95.5%～103.5%之间，水溶性草酸和总草酸含量顺序均为菠菜＞苋菜＞韭菜＞芫荽。该方法具有操作简便、干扰小、灵敏、回收率高等特点，适用于蔬菜不同形态草酸的提取测定。蔬菜；草酸；提取；离子色谱ExtractionandDeterminationofDifferentFormsofOxalateinVegetablesZENGFang，LIUZhong-zhen，XUGui-zhi，WANGRong-hui，OUJun(SoilandFertilizerInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongKeyLaboratoryofNutrientResourceCyclingandFarmlandConservation,Guangzhou510640,China)Abstract：TheeffectsoftemperatureandamountofaddedHClontheextractionofwater-solubleoxalateandtotaloxalatefromfourvegetables(spinach,amaranth,corianderandChinesechive)wereinvestigatedbyionchromatographicmethod.Thewater-solubleoxalatewasextractedusingwateratdifferenttemperatures,andtotaloxalatewasextractedusingdifferentamountsof0.5mol/LHClsolution.Thecentrifugationsupernatantofextractsweresupernatantdilutedandfiltratedwellenoughpriortoionchromatographicdetectionofoxalate.Thewater-solubleoxalatecontentsofspinachandamaranthincreasedwiththeincreaseoftemperature,andtheirtotaloxalatecontentsincreasedwiththeincreaseofadditionamountof0.5mol/LHClintherangeof0.5－2ml.WhilenosignificantchangesinboththetwoformsofoxalateinChinesechiveandcorianderwerefoundwhentemperatureandHCladditionamountwerechanged.Thebestextractionefficiencywasobtainedwhentotalandwater-solubleoxalateswereextractedusing2mlof0.5mol/LHClandboiledwaterfor20minrespectively.Therecoveriesofwater-solubleandtotaloxalateinthefourvegetableswerebetween95.5％and103.5％,andthecontentsoftotalandwater-solubleoxalatesbothdecreasedinthefollowingorder:spinachamaranthChinesechivecoriander.Thismethodiseasytooperate,withlittleinterferenceaswellashighsensitivityandrecoveryandthereforeisapplicabletothedeterminationofdifferentformsofoxalateinvariousvegetables.Keywords：vegetable；oxalate；extraction；ionchromatography中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1002-6630(2009)16-0216-04收稿日期：2008-09-23基金项目：广东省农业科学院土壤肥料研究所所长基金项目(2008-szjj-03)作者简介：曾芳(1982－)，女，硕士，研究方向为色谱分析。E-mail：[e-mail]草酸是植物体内普遍存在的一种二元羧酸，主要以游离态(草酸钠和草酸钾)和草酸钙结晶的形式存在，不同科属植物的草酸含量差异很大。从环境毒理学和食品营养学的角度看，草酸是一种环境毒素和抗营养因子，长期食用草酸含量高的蔬菜容易引发关节炎、低血钙、膀胱结石和肾结石等疾病[1-5]。另一方面，草酸在钝化重金属和增强植物抗逆性等方面起着重要的作用，是植物体内环境胁迫的响应因子，参与钙离子和pH值调节[6-9]。利用化学法或仪器分析法可以定量分析测定植物水溶性草酸和总草酸含量，总草酸和水溶性草酸的差值为难溶性草酸。水溶性草酸较易被人体吸收，进入体液循环系统，与人类健康关系较为密切，测定总草酸含量可217※分析检测食品科学2009,Vol.30,No.16为研究植物代谢生理提供重要信息。目前草酸的测定方法主要有容量法、比色法和色谱分析法[1,10-12]等，其中色谱分析法的灵敏度、检测限和回收率等指标均优于传统方法。已有研究利用液相或离子色谱分析大豆、茶叶、甘草等植物的草酸含量[12-14]，但对于蔬菜中水溶性草酸和总草酸的提取条件和影响因素的报道尚少。本实验以菠菜(SpinaciaoleraceaL.)、苋菜(AmaranthusmangostanusL.)、芫荽(CoriandrumsativumL.)、韭菜(AlliumodorumL.)4种不同科属的蔬菜为材料，利用离子色谱法测定它们的水溶性草酸和总草酸含量，比较不同提取温度和盐酸浓度对水溶性草酸和总草酸测定的影响，以期为蔬菜品质分析测定提供方法依据。1材料与方法1.1材料与试剂菠菜(藜科)、苋菜(苋科)、芫荽(伞形科)和韭菜(百合科)新鲜样品，测试当天购自农贸市场。氯化钠、硝酸钾、硫酸钾、草酸钠(优级纯)天津科密欧科技有限公司；氢氧化钠、盐酸(分析纯)广州化学试剂厂；超纯水。1.2仪器与设备DX-120型离子色谱仪[配电导检测器，ASRS300(4mm)自再生抑制器，HW-2000色谱工作站]美国戴安公司；3K15离心机Sigma公司；组织匀浆机；Milli-Q超纯水机；水浴锅。1.3方法1.3.1样品预处理将新鲜的蔬菜样品洗净晾干，取200g剪碎混匀的样品，加入150ml水，放入组织匀浆机中匀浆，用50ml水冲洗，冲洗液并入匀浆液混匀备用。称取2.0g匀浆液进行蔬菜草酸含量的测定。测定总草酸含量是加入一定量的HCl溶液浸提20min，然后用水定容至100ml。测定水溶性草酸是直接加水至50ml左右，水浴浸提，冷却后定容至100ml。经10000r/min离心10min，澄清，稀释(5～20倍)，过0.45μm滤膜后上机测定。1.3.2色谱条件IonPacAS11阴离子柱(4mm×250mm)，IonPacAG11保护柱，抑制电流：50mA；淋洗液：12mmol/LNaOH；流速：1.0ml/min；进样量：25μl。1.3.3标准曲线的绘制及检测限、重现性的测定草酸的定量分析采用外标法进行，用草酸钠作为基准试剂，配制0～30μg/ml的标准系列，测定不同浓度的草酸标准溶液的峰面积，回归分析得草酸的标准曲线。1.3.4不同盐酸加入量对蔬菜总草酸提取测定的影响植物体内的草酸主要以游离态和草酸钙结晶的形式存在，通常将用盐酸提取的草酸称为总草酸，用水浸提的草酸称为水溶性草酸，总草酸和水溶性草酸的差值为难溶性草酸。传统的高锰酸钾容量法中总草酸含量的测定使用3ml6mol/LHCl浸提[15]，而用离子色谱法测定时，使用高浓度的盐酸浸提，会造成待测液中含有大量的氯离子，过高的氯离子浓度易引起阴离子柱过载，降低柱效。因此，在不影响总草酸提取效果的前提下，盐酸浓度越低越好。在4种蔬菜中加入0.5、1、2、4ml浓度为0.5mol/L的HCl，考察盐酸加入量对总草酸提取测定的影响。1.3.5加标回收实验用2ml0.5mol/LHCl在沸水浴浸提20min的处理条件下作水溶性草酸加标回收实验。2结果与分析2.1草酸根与其他阴离子的分离图谱2.2标准曲线的绘制及检测限、重现性的测定结果经测定草酸标准曲线为y=6687.05x－27.36。在0～30μg/ml的范围内，草酸根浓度和峰面积呈显著正相关(r=0.9998，n=18，P＜0.0001)，可用于草酸的定量分析。通过分析不同浓度标准溶液信号和噪音的比值，得到草酸的检测限为0.05μg/ml(S/N=3)，重复测定11次的变异系数为1.8%。2.3不同盐酸加入量对蔬菜总草酸提取测定的影响如图1所示，草酸根与其他阴离子的分离较好，不受干扰，草酸根的出峰时间约为4.4min，蔬菜样品的草酸分离图谱见图2。图1阴离子标准谱图Fig.1Chromatogramofstandardanions76543210－1Cl－电导(μS)保留时间(min)1.522.533.544.55NO3SO4C2O422图2样品分离谱图Fig.2Chromatogramofvegetablesample43.532.521.510.50－0.5－1电导(μS)保留时间(min)C2O421.522.533.544.552009,Vol.30,No.16食品科学※分析检测218HCl加入量(ml)菠菜苋菜韭菜芫荽0.56439.6±51.52956.2±104.1509.6±4.2436.1±5.217004.5±109.45062.0±52.9512.0±8.4439.2±3.827517.0±51.96209.6±72.4510.4±5.9440.1±3.547524.7±40.96201.5±72.4509.0±4.3438.6±4.8表1不同盐酸加入量对总草酸提取测定的影响(mg/kgFW)Table1Effectsofdifferentadditionamountofhydrochloricacidonthetotaloxalate(mg/kgFW)水浴条件菠菜苋菜韭菜芫荽30℃水浴3525.1±11.71394.6±12.5469.1±5.9370.8±5.660℃水浴3563.1±24.71492.7±7.1476.4±6.5374.6±12.8沸水浴3844.0±58.61616.0±14.1474.9±9.2370.4±6.1表2不同提取温度对水溶性草酸的影响(mg/kgFW)Table2Effectsofdifferentextracttemperatureonthewater-solubleoxalate(mg/kgFW)项目总草酸水溶性草酸菠菜苋菜韭菜芫荽菠菜苋菜韭菜芫荽植株含量(mg/kg)7517.