抗体工程技术

第四章抗体技术第七章抗体工程技术1一、抗体类型1、多克隆抗体(polyclonalantibody)早期人工制备抗体的主要方法，以相应抗原免疫动物，由此产生的抗体是针对多种抗原决定簇（表位）的混合抗体，故称之为多克隆抗体。★第一节抗体制备2优点：来源广泛、制备容易缺点：特异性不高、易发生交叉反应3多克隆抗体1890年Behring和Kitasato发现白喉抗毒素，建立免疫疗法，开创了抗体制药之先河。白喉外毒素→免疫动物→抗毒素→治白喉Behring(德,1854～1917）4目前治疗性抗体产品：精制破伤风毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。绿脓免疫血浆抗体制剂5多克隆抗体的制备根据不同的免疫原，选择不同的免疫方案。免疫方案免疫途径免疫程序动物选择6细胞融合，又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。2、细胞融合技术和单克隆抗体7显微镜下细胞融合过程8Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。细胞融合研究进展91975年，Kohler和Milstein应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊细胞致敏的小鼠脾细胞融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤细胞，应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体。10一、何谓单克隆抗体？11★由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称单克隆抗体12131415单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。16NielsK.JerneG.KohlerC.Milstein17杂交瘤技术的基本原理183、基因工程抗体基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。19基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点：通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体。可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。20整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术21经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞，可以合成分泌单一性的抗体，我们称这种具有特异性的、同质性的抗体为单克隆抗体。二、McAb技术基本原理22改变B淋巴细胞遗传特性建立永久生长和能分泌McAb细胞系的途径病毒转化细胞杂交23骨髓瘤细胞选择•骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体•选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）•胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）24*融合细胞的选择原理1964年Litterlefield首先发明HAT选择性培养基。H：Hypoanthine次黄嘌呤A：Aminopterin氨基喋呤T：Thymidine胸腺嘧啶脱氧核苷原理：正常细胞不但具有利用培养液中的谷酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力,且当这条主要途径被氨基喋呤（A）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路来合成DNA的能力。25三、McAb技术的特点1、高度特异性2、高度稳定性3、高抗体活性4、不可知性5、过于单一性26★四、McA制备的基本方法（一）抗原提纯与动物免疫27（二）骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备对数生长期的骨髓瘤细胞SP2／0(HGPRT缺陷株)的准备脾细胞的准备28融合前骨髓瘤细胞:细胞状态浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布29（三）细胞融合融合过程须注意问题1、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1：42、反应时间：混合细胞的离心管中30s内加入1ml37℃预温的50％PEG，边加边轻轻摇动离心管，作用90s，然后加入预温的37℃的DMEM不完全培养液终止PEG作用，800r/min离心6min，弃上清。3、培养液成分30（四）筛选和克隆有限稀释法(稀释至0.8个细胞/孔)（五）单克隆抗体的制备和冻存（六）单克隆抗体的纯化（制备方法：体内培养、体外培养）（盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、酸沉淀）31★四、McA制备的基本方法32★五、单克隆抗体的应用1、作为亲合层析的配体2、作为生物治疗的导向武器3、作为免疫抑制剂通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分McAb所带药物只作用于靶组织器官抗人的T淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应334、作为研究工作中的探针5、增强抗原的免疫原性6、作为医学检验试剂（1）诊断各类病原体（2）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测（3）检测淋巴细胞表面标志（4）机体微量成分的测定34CJPEB1重组蛋白的表达及单克隆/多克隆抗体的制备鉴定35课题的思路及目的诱导培养基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表达CJPEB1重组蛋白镍琼脂糖层析柱纯化表达后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备单抗免疫新西兰兔制备多抗为建立血清学方法检测CJ创造条件36一、SDS-PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白123456M78910图1.SDS–PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白表达的蛋白通过镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后，经SDS-PAGE鉴定，蛋白质分子量大小与预计的理论值相符，和本室前期的研究结果一致，PEB1重组蛋白纯度高。1～2：咪唑浓度为50mmol/L时洗脱的蛋白3～4：咪唑浓度为100mmol/L时洗脱的蛋白5～6：咪唑浓度为200mmol/L时洗脱的蛋白M：蛋白质标准分子量7～8:咪唑浓度为300mmol/L时洗脱的蛋白9～10:咪唑浓度为400mmol/L时洗脱的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd37PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定常规免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体38X-a-b-c-d-a-b-c-d抗原决定簇BALB/Cabbcd脾脏产生各种B細胞与佐剂乳化免疫采血收集血清作为筛选时阳性对照无菌取脾脏收集B细胞抗原通常有多个抗原决定簇免疫后的脾脏约在两月內注射四次PEB1蛋白39-d-a-b-c-dPEB1蛋白ELISAHATPEG细胞融合杂交瘤细胞（亚克隆）(确定只有单个细胞)-d-c-b-a-dSP2/0骨髓瘤细胞Bcell脾细胞培养筛选只识别一个抗原决定簇abbcd合混胞细选筛抗单40单克隆抗体的获得及鉴定细胞克隆的形成和杂交瘤细胞的筛选图2.融合后第二天骨髓瘤细胞对照孔图3.融合后第二天细胞融合孔41图4.融合后第三天细胞融合孔图5.融合后第八天细胞融合孔42图6.间接ELISA筛选抗体阳性孔43通过有限稀释法和ELISA法进行连续克隆筛选后获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1D7A5株和5G2B3株。44图8.1D7A5株分泌抗体的亚型图9.5G2B3株分泌抗体的亚型451D7A5株和5G2B3株杂交瘤细胞诱生的腹水经间接ELISA法检测，腹水中的抗体效价分别为1:8×104和1:5×104。两株杂交瘤细胞诱生的腹水经双向琼脂扩散试验检测，腹水中的抗体效价均为1:8。46运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分泌的单抗的亚型。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测的腹水中单抗的效价。通过Western-blot和玻片凝集试验检测单抗的特异性。47免疫印迹试验结果显示：2株杂交瘤细胞分泌的单抗，可以与PEB1蛋白特异性结合。通过DAB显色出现特异性条带并且无杂带出现。1234M1～2：未经纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合3～4：纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合M：蛋白质标准分子量图10.western-blot检测单抗特异性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd48细菌名称杂交瘤细胞诱生的腹水SP2/0细胞诱生的腹水空肠弯曲菌++－大肠杆菌－－痢疾杆菌－－伤寒杆菌－－产气荚膜杆菌－－变形杆菌－－葡萄球菌－－表1.玻片凝集试验检测单抗的特异性结果49三、PEB1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定免疫新西兰兔制备多克隆抗体。50123412431234XPEB1蛋白与佐剂完全乳化待血凝完全离心收集血清盐析法粗提兔IgG抗体51应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测多克隆抗体抗体的效价。通过Western-blot和玻片凝集试验检测多克隆抗体的特异性。52多克隆抗体的效价检测及鉴定动物编号0W2W4W6W7W8W兔101:101:1021:6×1031:8×1031:1.5×104兔201:101:5×1021:8×1031:1×1041:2×104兔301:101:5×1021:8×1031:1.2×1041:2.5×104表2.间接ELISA检测兔血清的效价变化间接ELISA检测兔血清的效价变化53表3.双向琼脂扩散试验检测免疫后的抗体效价变化动物编号0W2W4W6W7W8W兔101:11:21:41:81:8兔201:11:41:81:161:16兔301:11:41:81:161:16•双向琼脂扩散检测免疫后的抗体效价变化54Western-blot试验检测多抗的特异性12M1：未经纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合2：纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合M：蛋白质标准分子量免疫印迹试验结果证实：所获得的多抗与PEB1蛋白特异性结合。通过DAB显色出现特异性条带并且无杂带出现。图11.western-blot检测多抗特异性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd55第三节抗体蛋白的分离纯化一、抗体蛋白的提取水溶液提取法、有机溶剂提取法二、抗体蛋白的分离纯化1、溶解度不同分离蛋白质的盐析等电点沉淀法低温有机溶剂沉淀法2、分子量大小分离透析与超滤凝胶过滤（分子筛层析）3、带电性质不同电泳法离子交换层析法4、配体特异性－亲和色谱法56盐析沉淀用中性盐类使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。沉淀蛋白质所需盐类浓度视蛋白质种类而异。常用的有：硫酸铵、硫酸镁、氯化钠57