胰岛素粗品的提取

1胰岛素粗品的提取——酸醇提取减压浓缩法（一）实验目的：1、了解胰岛素的作用与性质；2、掌握胰脏中提取胰岛素的工艺过程；3、通过熟悉胰脏的粗提纯，培养学生生物分离手段应用的能力。（二）实验器材与药品：空调，冰箱，组织捣碎机（绞肉机），天平，大转头低温离心机，蒸发浓缩仪，真空干燥箱，密度计，水浴加热锅，制冰机；剪刀，烧杯（1000ml），量筒，温度计，玻棒，滴管（2），纱布（粗布），漏斗，滤纸，PH试纸（酸、碱），注射器；猪胰，H2SO4，酒精，浓氨水，NaCl，草酸，无水丙酮。（三）实验步骤：材料预处理：胰脏最好采用-30℃速冻法，贮存在-20℃，保存不超过8个月。材料处理：将猪胰除去结缔组织等杂质，绞碎成胰浆。提取：称一定重量（200g）置烧杯中，加入2.3～2.6倍量86-88%的醇和草酸。草酸为冻胰脏的5%。（先将草酸溶于事先配制好的乙醇中）。（PH应为2．5～3．0，醇含量为70%左右）。在温度为10～150C下搅拌（60/min）提取3h。离心（粗布过滤），残渣再用一倍量68-70%乙醇和0.4%草酸提取2h。离心（粗布过滤2次），合并二次浸出液。[操作重要参数]：1）、PH为2.5～3.0（胰岛素在酸性条件下稳定）2）、乙醇含量为70%左右。（在此浓度下，胰岛素溶解度比较大，过高会使胰岛素变性）23）、温度为10～15℃（低温，保持胰岛素活性）碱化、酸化：提取液在不断搅拌下（35/min）加入浓氨水，调pH达8．0～8.4(液温10-15℃)，立即进行过滤（除去碱性蛋白质）（可离心），于澄清的滤液中迅速加入10%硫酸使pH调至3.6～3.8。在5℃静置4-6h以上（使酸性杂蛋白沉降）。[操作注意事项]：去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性（在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）。减压浓缩：吸取上清液，下层沉淀用纱(帆)布过滤，滤液并入上清液，清液在300C以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04-1.06（约为原体积的1/9～1/10）为止。(冷凝器之冷却水应在-15℃以下,真空在740泵柱以上进行真空浓缩)。[操作目的]：在这步操作中，主要是用来缩小溶液的体积，浓缩至一定的浓度以便于下步的盐析操作。去脂、盐析：将浓缩液在5min之内加温至500C，立即用冰（盐）水降温至50C，放置3～4h，分离出下层清液（上层脂肪可回收胰岛素），调pH达2.3～2.5。在20～250C下搅拌加入27%(W/V)固体氯化钠，使全部溶解，保温静置2～4h，析出沉淀。[操作原理]：脂肪加热溶解，密度小，浮在上层液，迅速冷却将其去除。洗涤、干燥：用滤纸（绢布）滤集沉淀，再用无水丙酮洗涤数次（除去剩余的脂肪和水），300C以下真空干燥（5-10h）得粗制品。称重。(四)、实验记录与结果分析：注：质量浓度W/V=g/mL3胰岛素简介一、胰岛素来源：胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，是胰岛B（β）细胞分泌的一种分子量较小的蛋白质激素。（猪胰岛素分子量为5761）。根据采用的原料和手段的不同，制造的方法有提取法、生物技术法、化学合成法。但主要以提取法为主，比较成熟且被普遍采用的是酸醇提取减压浓缩法，原料多用猪的新鲜胰脏。二、胰岛素的性质：胰岛素为白色或类白色无定形粉末，易溶于稀酸或稀碱水溶液中，也易溶于酸性（或碱性）稀醇（80%以下）和稀丙酮水溶液中，在其他无水有机溶媒中均不溶。在酸性溶液中（如pH3.5）较稳定，在碱性溶液中极易失活性，其他凡能改变蛋白质结构的因素如加热（800℃以上）、强酸、强碱和蛋白酶等都可使胰岛素受到破坏。三、胰岛素的功能：胰岛素是促进合成代谢的激素，在调节机体糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢方面都有重要作用，它是维持血糖在正常水平的主要激素之一。胰岛素一方面能促进血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞并在细胞内合成糖元或转变成其他营养物质贮存起来；另一方面又能促进葡萄糖氧化分解释放能量，供机体利用。由于胰岛素既能增加血糖的去路又能减少血糖的来源，因此其最明显的效应是降低血糖。