药物生殖毒性研究

生殖毒性生殖毒性研究（Reproductivetoxicitystudy）药物进入临床研究及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行生殖毒性试验。在药物开发的过程中，生殖毒性研究的目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。基本原则•（一）实验管理•必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。•（二）具体问题具体分析•（三）随机、对照、重复基本内容•1、受试物•1.1中药及天然药物•应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。•如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。•试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。•1.2化学药物•应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。•所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。•2、受试物药代动力学研究•在开始生殖毒性试验前，掌握一些受试物药代动力学方面的信息，对于是否应进行动物种属选择、试验设计与给药方案的调整等有重要提示作用。•这些药代动力学信息可能来源于非妊娠或非哺乳期动物。•在进行结果评价时，可能有必要进一步研究妊娠或哺乳期动物的药代动力学情况。•3、试验系统•3.1实验动物•应采用哺乳动物进行生殖毒性试验。•在选择动物种属和品系时，应考虑动物的背景资料、实用性、与人的相关性等。•通常选用年轻、性成熟的成年动物，雌性动物未经产。•个体动物初始体重不应超出平均体重±20%。动物特点•大鼠•对性激素敏感；•不适合用于多巴胺受体激动剂的研究，因其早期妊娠的发生和维持所依赖的激素主要是催乳素；•妊娠后期对非甾体抗炎药高度敏感。•进行生殖毒性研究通用的较佳动物种属，首选•小鼠：•代谢率高，易惊、群体畸形现象（所有种属动物均会出现）特别明显，胎仔小。•进行生殖毒性研究通用的较佳动物种属，次选•家兔：•常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，临床表现的解释较困难。•在胚胎-胎仔发育毒性研究中，优先选用的非啮齿类动物•家兔的精液样品可不借助于痛苦性的技术（如电刺激采精）而获得，可用于精液分析研究。•豚鼠：•常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，胎仔发育期长，历史背景资料不足。•家猪和/或小型猪：•群体畸形的背景情况多变,所需的受试物量大，需要较大饲养空间，历史背景资料不足。•白鼬：•如果不采用特殊的管理系统，只能季节性繁殖（其成功与否主要取决于人和动物的相互影响），历史背景资料不足。•仓鼠：•静脉给药虽非不可能，但相当困难，会将受试物存于颊部小囊中而影响实际给药量•攻击性非常强•对肠道功能紊乱敏感，对许多受试物有过度敏感的致畸反应，胎仔小。•犬：•季节性繁殖，多近亲繁殖，历史背景资料不足。•犬的精液样品可不借助于痛苦性的技术（如电刺激采精）而获得，可用于精液分析研究。•非人灵长类动物：•与其他种属动物一样，其药代动力学情况与人不同，历史背景资料不足，常常因为其只数太少而难以进行危险性评估。更适合用于进行明确生殖毒性物质（该毒性已比较肯定）特性的试验研究，而不是评估其危险性。•3.2其他试验系统•其他试验系统指哺乳动物或非哺乳动物的细胞、组织、器官，体外或体内培养体。•这些系统的试验结果有助于作用机理的分析，但它们缺乏发育过程的复杂性以及母体与生长机体（胚胎）间动态的相互变化。•尚不能替代目前生殖毒性试验常用的整体动物给药•4.1剂量选择•4.1.1中药及天然药物•可根据已有的研究资料（药理、急性毒性和长期毒性、药代动力学研究）或预试验以及受试物的理化性质和给药途径来进行剂量设计。•至少应设三个剂量组。•高剂量应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。•低剂量应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量水平（NOAEL）”。•4.1.2化学药物•高剂量范围内应该出现一些轻微的母体毒性反应，在大多数情况下，1g/kg/天为最大给药限量。•低剂量应为生殖毒性方面的NOAEL。•高剂量与低剂量间根据具体情况可设计1～2个剂量，以观察可能的剂量反应关系。•4.2给药途径•一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。•如果拟用途径有多种，若研究提示不同给药途径的药代动力学特点（包括分布）类似，建议采用暴露量较高的给药途径。•经口给药，通常使用灌胃给药法。掺食法（饲料/饮水）一般不采用。•腹腔注射时可能会对子宫或胎仔产生直接作用，故采用妊娠动物进行试验时，一般不用该途径。•4.3给药频率•通常每天给药1次。•应参考药代动力学参数、预期临床给药情况增加或减少给药次数。生殖毒性和发育毒性评价生殖毒性:外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害。发育毒性：外源化学物对胚胎发育和出生幼仔发育的影响。可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段：•A.从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。•B.从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。•C.从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。•D.从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。•E.从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。•F.从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。（二）试验方案•对大多数药物而言，三段试验方案（常用的试验方案）通常比较合适，能够识别有可能发生损害的生殖发育阶段。•对于化学药物来说，如果给药剂量达2g/kg而不致死，且重复给药毒性试验剂量达1g/kg时未出现毒性，可仅进行单项包括两代的生殖毒性试验，包括两受试物组（0.5g/kg和1.0g/kg）与一个对照组。评价方法:（1）生育力与早期胚胎发育毒性试验：对雌雄动物由交配前到交配期直至胚胎着床给药评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等。（2）胚胎-胎仔发育毒性试验：妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合给药，评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎胎仔死亡、生长改变和结构变化等。（3）围生期毒性试验：检测从胚胎着床到幼仔离乳给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和子代发育的不良影响评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代死亡情况、生长发育的改变以及子代的功能缺陷，包括F1代的行为、性成熟和生殖功能。生育力与早期胚胎发育毒性试验1动物选择•至少采用一种动物，推荐用大鼠。不少于20只/性别/组。2给药期•交配前给药期可定为雄性动物4～10周，雌性动物2周；•雄性动物给药期应持续整个交配期直至被处死•雌性动物至少应持续至胚胎着床（妊娠第6～7天）。3动物处理•建议雌雄动物按1:1交配。•雌性动物在妊娠第13～15天处死，雄性动物在交配成功后处死。观察指标试验期间：•-体征和死亡情况，至少1次/天•-体重和体重变化，至少2次/周•-摄食量，至少1次/周(交配期除外)•-交配期间至少每日进行阴道涂片检查，以检查是否对交配或交配前时间有影响•-其他毒性研究中已证明有意义的指标•计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算着床数终末检查：•-剖检所有亲代动物•-保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物的相应器官以便比较•-保存所有动物的睾丸、附睾或卵巢、子宫，必要时进行组织学检查，根据具体情况进行评价•-建议计数附睾中的精子数并进行精子活力检查胚胎-胎仔发育毒性试验（II段）•动物选择•通常采用两种动物：啮齿类动物推荐用大鼠；非啮齿类动物推荐用家兔。•通常大鼠不少于20只/组，家兔不少于12只/组。•给药期•由胚胎着床到硬腭闭合(即到C阶段末)给药。通常，大鼠为妊娠第6～15天给药，家兔为妊娠第6～18天给药。•动物处理•在大约分娩前处死并检查雌性动物，正常情况下，大鼠约为妊娠第20/21天，家兔约为妊娠第28/29天。检查所有胎仔的存活和畸形情况。•当所用技术方法要求分别检查软组织和骨骼改变时，最好是每窝分配50%的胎仔进行骨骼检查。•至少应对50%的大鼠胎仔进行内脏检查。•对于家兔，检测软组织改变，采用新鲜显微解剖技术较适合，100%的家兔胎仔需进行软组织和骨骼检查。•评价胎仔的内脏和骨骼异常情况时，若高剂量组与对照组无显著性差异，一般不需要对中、低剂量组动物进行检查。观察指标•试验期间：•-体征和死亡情况，至少1次/天•-体重和体重变化，至少2次/周•-摄食量，至少1次/周•-其他毒性研究中已证明有意义的指标•终末检查：•-剖检所有成年动物•-保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物相应器官以便比较•-计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算着床数•-胎仔体重，胎仔顶臀长•-胎仔异常（包括外观、内脏、骨骼）•-胎盘肉眼观察•胎仔骨骼检查围产期毒性试验（III段）•动物选择•至少采用一种动物，推荐用大鼠，通常不少于20只/组。•给药期•雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束，大鼠为妊娠第15天至离乳（出生后第21天）。•为检测可能用于婴幼儿和儿童期药物的不良影响，应选择特定年龄段子代直接给药，进行相关试验研究。•动物处理•雌性动物分娩并饲养其子代至离乳，每窝选择雌、雄子代各1只，饲养至成年，然后进行交配检测其生殖能力。观察指标•试验期间(母体动物)•-体征和死亡情况，至少1次/天•-体重及体重变化，分娩前至少2次/周•-摄食量，分娩前至少1次/周•-其他毒理研究中已证明有意义的指标•-妊娠期•-分娩•终末检查（用于母体，可行时也用于子代)：•-剖检所有成年动物•-保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物相应器官以便比较•-着床•-畸形•-出生时存活的子代•-出生时死亡的子代•-子代出生时体重•-离乳前后的存活率和生长/体重，性成熟程度和生育力，应说明是否进行了窝仔动物剔除•-体格发育•-感觉功能和反射•-行为•3.1单一（全程）试验设计（啮齿类动物）•如果将生育力和围产期试验连贯在一起全程给药，则可对生殖过程从A到F各阶段的情况进行评价。•假如该试验中包括了对胎仔的检查，且在足够高的给药剂量下得出了明确的阴性结果，可不再进行进一步的啮齿类动物生殖毒性试验。•胎仔结构异常检查也可在附加的一项（或多项）胚胎-胎仔发育试验中进行，而成为两段试验。•此外，还应进行第二种动物胚胎-胎仔发育影响试验。推荐采用家兔。•两段试验设计（啮齿类动物）•最简单的两段试验设计为生育力试验和围产期试验。•目前研究认为，如果受试物在动物中的暴露量达到人体暴露量以上的足够范围时，围产期试验中并未发现其对产前发育有影响，那么在大多数情况下，再进行胎仔检查也不能显著改变其危险性评价的结果。•生育力试验中雌性动物给药期可持续至胚胎硬腭闭合，并参照胚胎-胎仔发育试验中的方法对胎仔进行检查。这种与围产期试验联合考虑的两段试验设计，可进行“常用的试验方案”中要求的所有检查。•此外，还应进行第二种动物胚胎-胎仔发育影响试验。推荐采用家兔。结果分析•应对受试物在动物中表现出来的生殖和发育两方面的毒性进行分析评价。•如果出现阳性的生殖毒性或发育毒性结果，应评估人体中出现生殖毒性和发育毒性风险的可能性，这些阳性的毒性结果可能是在生殖毒性或一般毒性试验中出现的，也可能是在人体研究中出现的。•1、生殖毒性•生殖毒性为可