细菌检测方法研究进展

细菌检测方法研究进展Contents细菌传统检测方法1细菌免疫学检测方法2细菌分子生物学检测技术3展望4随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌检测技术和方法已广泛用于病原微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的检测以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学检测方法，尤其分子检测技术的发展和应用，明显提高了细菌的检测水平。1细菌传统培养检测方法1.1分离培养检测及鉴定方法食品中病原菌的传统检测方法是将分离培养后的可疑菌落做涂片染色实验、生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验（CAMP）、动物实验及典型运动等鉴定等。1细菌传统培养检测方法1.2显色培养基快速检测技术显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基。它是一种新型分离培养基，利用显色培养基进行微生物的筛选分离，其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基。1细菌传统培养检测方法1.2显色培养基快速检测技术例：大肠杆菌/大肠菌群显色培养基：用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。1细菌传统培养检测方法1.3API生化鉴定系统主要依据API试剂条的生化反应结果将一种/组细菌与其它细菌相鉴别，并用%id(鉴定百分率)表示每种细菌的可能。各类API试剂条均由多个生化反应组成，编码即是将生化反应谱转换成数码谱，以便于使用生化反应检索手册或API电脑分析软件进行检索，确定生化反应谱对应的是什么细菌。1细菌传统培养检测方法1.3API生化鉴定系统API（AnalyticProductsINC）系统用于细菌鉴定的品种有15种，分别有相应的数据库。数据库由细菌条目(taxa)组成，每个条目可能因情况的不同代表细菌种、细菌的生物型、细菌的菌属。2细菌免疫学检测方法2.1免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。2细菌免疫学检测方法2.2免疫层析技术免疫层析技术一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法。原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫检测。2细菌免疫学检测方法2.3纳米免疫磁珠技术纳米免疫磁珠技术是以抗体包被纳米磁珠的为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合。本方法最大程度地提高该致病菌的检出率及灵敏度，在24h能够检出病原菌。2细菌免疫学检测方法2.4酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将己知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶(HRP)为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。2细菌免疫学检测方法2.4酶联免疫吸附试验应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。2细菌免疫学检测方法2.5乳胶凝集实验（LAT)LAT是以乳胶颗粒作为载体的一种间接的凝集试验。利用人工大分子乳胶颗粒抗体，吸附可溶性抗原于其表面发生肉眼可见的凝集反应，以达到检测目标细菌的目的。乳胶凝集试验由于具有快速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点，已广泛用于多种病原菌的检测以及流行病学调查中。2细菌免疫学检测方法2.6免疫印迹法（Westernblot)免疫印迹法又称为蛋白质印迹法，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。它综合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性，是一种有效的分析手段，广泛应用于细菌的检测中，但该方法操作复杂，耗时费力。2细菌免疫学检测方法2.6免疫印迹法（Westernblot)3细菌分子生物学检测技术3.1核酸探针检测技术根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂交反应和液相杂交反应。固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应，如常见的印迹法和菌落杂交法。液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快。缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入反应体系中的干扰剂。3细菌分子生物学检测技术3.2PCR检测技术聚合酶链反应(PCR)是一种体外扩增DNA技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，模板DNA就可得到大量扩增。3细菌分子生物学检测技术3.2PCR检测技术实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数3细菌分子生物学检测技术3.3DNA环介导恒温核酸扩增法原理：针对靶基因的特定区域设计1种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymcrasc)在65℃左右恒温保存几十分钟，即可完成核酸扩增反应，且1h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分子的影响较小。同时，在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，并且模板也不需要进行热变性，从而保证了LAMP扩增的高效特异性。3细菌分子生物学检测技术3.3DNA环介导恒温核酸扩增法DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、基于酶反应的，可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸扩增方法，具有高特异性和等温快速扩增的特点。例：志贺菌检测3细菌分子生物学检测技术3.4CRISPR检测近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR)广泛分布于细菌和古细菌中。CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列构成的R-S结构组成，其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPRassociated，cas)组成CRISPR/cas系统，为原核生物提供对噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力，从而抵抗噬菌体感染，限制基因的水平转移(HGT)。3细菌分子生物学检测技术3.4CRISPR检测例：志贺菌CRISPR的检测3细菌分子生物学检测技术3.5DiversiLab系统DiversiLab系统是基于重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)技术原理的半自动基因分型方法，通过PCR扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片段的多态性比较菌株间相似性，其操作简单、可重复、数据标准化，可广泛应用于医院感染菌的快速检测分型。3细菌分子生物学检测技术3.5DiversiLab系统例：DivcrsiLab系统对医院感染的鲍曼不动杆菌进行同源性分析3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术可变数串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeat,VNTR)通常由二个核甘酸组成的单元如“胞嘧啶+腺嘌呤”(CA)经过若干次重复组成，由于重复的次数(即n值)是可变的，因而构成一种多态类型。VNTR是近年提出的概念，因其在基因组中分布极为丰富，故应用日趋广泛。就某一VNTR而言，通常重复单元可以表现出几次到几十次不同的重复，并由此决定不同的长度类型，因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大。3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型3细菌分子生物学检测技术3.7焦磷酸测序技术在细菌鉴定分型的分子生物学方法中，能够提供核酸碱基序列资料的分子检测技术成为细菌鉴定分型的金标准。焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短片段DNA序列分析的方法，是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的技术。3细菌分子生物学检测技术3.7焦磷酸测序技术例：焦磷酸测序技术检测沙门氏菌4展望病原微生物的自动化系统病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，在病原微生物的检测分型和预防控制领域具有十分重要的应用价值。由于其所需样品和剂量较少、快速省时、检测结果精确、自动化操作程度较高，适宜用于食源性病原微生物的检测与分型。4展望病原微生物的自动化系统目前，最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。该套系统含有14种检测卡片，每一种鉴定卡片有25种以上的生化反应指标。操作时，先将一定浓度的欲鉴定菌株菌悬液接种到各种细菌的小卡上。仪器会自动检测最后由计算机判定，打印出鉴定结果。该技术在细菌的检测分型和预防控制领域具有十分重要的应用价值。