肝酶的分离提取

开题报告：肝酶的分离提取与纯化鉴定内容从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和实施方案肝酶的分离提取纯化和鉴定一、生物大分子的分离纯化方案生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、多聚糖等。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。前期准备（一）明确目的和要求（二）了解的生物大分子的物理化学性质溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、pH1、分离生物大分子的一般步骤材料的预处理材料的粗提取材料的精细分离鉴定材料的预处理——组织细胞破碎1、机械破碎法•高速组织捣碎机、匀浆器、研磨器2、物理破碎法：如超声波处理、反复冻融法3、酶学破碎方法•酶解法、自溶法（利用细胞自身的水解酶是细胞破碎）4、化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。生物大分子的精细分离性质具体方法分子大小和形态差速离心、超滤法、分子筛、透析溶解度盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等电荷差异电泳、等电点聚焦、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤法生物功能专一性亲核层析生物大分子含量的测定和纯化鉴定•测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。•测定蛋白质和酶总量——凯氏定氮法，Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。•测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。二、设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶（该酶由三个不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线实验思路材料预处理——处理肝脏酶的初步分离——盐析、等电点沉淀酶的精细分离——因只知道该酶的等电点，采用离子交换柱层析鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳材料的选择因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸等物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。细胞破碎细胞破碎可选用三种方法：机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法。本次使用机械破碎法中的匀浆法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。加入蛋白酶抑制剂：加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶的水解作用。常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）材料的处理除核酸：一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。离心：由于该酶的位置未知。故应用超速离心分离技术分离胞液中的酶体和微粒体，细胞核和线粒体。对三种成分分开研究，使得提取物中杂质减少。超速离心分离技术的原理：细胞内不同结构的比重、大小和形态都不相同，在同一离心场中沉降速度不同。可根据这一原理，用差速离心法和密度梯度离心法将亚细胞组分分离。酶的初步分离提取常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。因本实验中对此种酶的了解有限，但是已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用等电点沉淀法进行分离。等电点沉淀法等电点沉淀法：利用蛋白质可两性解离的性质，两性电解质在等电点时溶解度最低，通过调节溶液的pH值，使酶以沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附近一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。盐析中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷和水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。且沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。透析用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。透析法利用蛋白质和盐离子分子大小不同，盐离子小能透过透析袋而蛋白质分子不能，由此可除去盐离子。如何保持酶的活性是整个实验需要考虑的重要问题。为此，我组同学认为实验中应考虑以下几点问题。1.由于丙酮等有机溶剂会降低肝组织的活性，所以，最初取得的肝组织应保存在4°C,含20%甘油的pH=7.0的EDTA中（Colnen1968)2.由于重金属元素会大大降低酶的活性，故实验中应采用玻璃仪器蒸馏的蒸馏水配置溶液(CospeichPeter1951)步骤1.取动物肝组织选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水冲洗2.对肝组织进行预处理（梯度离心获得含有酶的细胞液）•在冰块中用小剪剪碎肝脏，移入插在冰块中洗净的匀浆器中进行匀浆•分次加入0.25mol/L冰冷蔗糖10ml，匀浆液经32层纱布（或双层尼龙织物）过滤，得匀浆液•离心管中加入5ml0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在其上，1600r/min离心10min，得上清液（1）•沉淀加10ml0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min，得上清液（2）•将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心10min，得上清液，即为酶体和微粒体3.初步分离提取1）配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.22）将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静置一段时间3）离心，去上清，留沉淀4）加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液酶的精细分离本实验采用离子交换层析法纯化目的酶DEAE-纤维素为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换剂。其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。由于静电荷作用，在等电点时，两性离子不显电性在pHpL的条件下带正电荷在pHpL的条件下带负电荷DEAE-纤维素为阴离子交换剂，在PH=6.3时带有正电荷。能吸引pL6.3的蛋白，而pL6.3的蛋白不与DEAE-纤维素结合，因而留在溶液中，弃掉流出液。再将乙酸铵缓冲液的pH值调到pH=6.1,此时pH=6.1的DEAE-纤维素可吸引pL6.1的蛋白，将pL6.1的蛋白质洗脱出来，并使pL6.1的蛋白留在溶液中，即得pI约为6.2的蛋白质。每收集一管液体，取一滴滴至玻璃板上加20％磺基水杨酸试剂检验有无蛋白质流出，如有则成白色浑浊，将每个蛋白质组分峰所涉及的试管中蛋白质的溶液合并，则该峰为纯化的目的酶pH=6.2实验步骤1.DEAE-纤维素处理为PH值为6.32.装柱与平衡（乙酸铵溶液）3.样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集最后一个峰的蛋白溶液4.处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.15.装柱与平衡（乙酸铵溶液）6.样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第一个峰的酶溶液即为PI=6.2左右的蛋白质7.将两次收集蛋白质混合即为所得酶液活性鉴定纯度鉴定1、结合酶由酶蛋白和辅助因子两部分组成。辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度与作用特点不同可分为辅酶与辅基。辅酶与酶蛋白的结合疏松，可以用透析或超滤的方法除去。辅基则与酶蛋白结合紧密，不能通过透析或超滤将其除去。酶的辅助因子多为复合有机或金属有机化合物，或金属离子。2、SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。分离胶的孔径有一定大小，不同分子量的蛋白质通过时受到的阻滞不同。这种分子筛效应将不同大小的蛋白质相互分开。1、若该酶含有辅基，则直接加入底物，通过观察底物浓度变化或产物生成速率来判断酶活性；2、若该酶含有辅酶，则加入其辅助因子后再加入底物，然后观察比较。Ps：该步必须在纯度鉴定前进行在进行完前面的每一个步骤后最好都进行一次活性检验，这样可以及时发现问题，减少后续的不必要的工作。1、待测样品的制备（酶液16μl+5*loadingBuffer4μl→90-100℃煮沸5-10min）2、制胶3、上样4、电泳5、染色（0.25%考马斯亮蓝R250溶液中染色10-15min）6、脱色（漂洗几次后加脱色液）由于该蛋白质有三个大小不同的亚基，会形成三条不同区带，所以若被测蛋白质分离纯度高，凝胶板上会出现三条区带。谢谢大家！