基因工程-6-外源基因的表达

四外源基因的表达基因工程技术的核心是基因表达技术。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。基因表达在原核生物与真核生物中的差别1.外源基因的起始转录2.mRNA的延伸与稳定3.外源基因mRNA的有效翻译4.表达蛋白在细胞中的稳定性第一节外源基因表达的机制4、表达蛋白在细胞中的稳定性4.1避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统第二节外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统（一）大肠杆菌基因表达载体1、大肠杆菌基因表达载体DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统（1）DNA复制及重组载体的选择系统1.1复制子常见的复制子松弛复制型，每细胞质粒拷贝数10～20个。严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。1.2选择标记微生物表型选择标记显性标记营养缺陷型标记（2）外源目的基因的转录系统这一系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子。抑制物基因（3）蛋白质的翻译系统3.1核糖体结合位点（SD序列）3.2翻译起始密码子3.3翻译终止密码子由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。（4）常见的大肠杆菌表达系统Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统：是以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统。4.1Lac和Tac表达系统由启动子Plac+操纵基因lacO+外源基因组成。Tac=Trp(-35)+PlacLacIPLac4.2PL和PR表达系统λ噬菌体转录启动子PL、PR构建的载体，这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录，42度下解除抑制开始转录。PL/PRcI857(ts)4.3T7表达系统T7噬箘体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。受体菌通常为E.coli.BL21(DE3)（4）外源基因的表达形式（一）不溶性蛋白-包涵体蛋白1.包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。2.包涵体存在部位：细胞质、细胞周质3.包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。4.包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：①折叠状态的蛋白质的聚集作用；②非折叠状态的蛋白质的聚集作用；③蛋白质折叠中间体的作用。（二）可溶性蛋白-融合蛋白融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。1.融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：①可溶性状态存在②表达效率高③稳定性好④较易于分离纯化2.3GST融合表达系统表达融合蛋白物ｐＧＥＸ是在载体上接上了一种２６ｋＤ的谷胱甘肽Ｓ－转移酶基因。第三节外源基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性mRNA的方法检测特异性蛋白质的方法报告基因的酶法检测定量RT-PCR法一、外源基因转录产物的检测1.定量RT-PCR技术可以检测外源基因是否转录出mRNA及mRNA表达水平PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系一、外源基因转录产物的检测1.定量RT-PCR技术1.1荧光染料和荧光探针1.1.1SYBRGreenI1.1.2TaqMan探针1.1.3分子信标（molecularbeacon）1.1.3LUXPrimers一、外源基因转录产物的检测1.定量RT-PCR技术1.1荧光染料和荧光探针1.1.1SYBRGreenI一、外源基因转录产物的检测1.定量RT-PCR技术1.1荧光探针和荧光染料1.1.3TaqMan探针2.1、报告基因的酶法检测报告基因必须具备两大特点：①其表达产物及其功能在未转化的细胞中并不存在；②其表达产物便于检测。二、外源基因蛋白产物的检测2008年度诺贝尔化学奖下村修钱永健马丁·查尔菲①Beta桶状结构，直径30Å高40Å②外部有11个反向平行的beta折叠（绿色）③内部有alpha螺旋（亮蓝色）④中心部有一个荧光基团（黄色）2.1.1GFP（GreenFluorescentProtein）结构特点①荧光稳定②检测方便③无种属特异性,也没有细胞种类和位置的限制④GFP对受体细胞基本无毒害⑤不受假阳性干扰。⑥不需任何反应底物和辅助因子;⑦可制成永久标本。⑧灵敏度高。2.1.2GFP用作标记蛋白具有的优点