质谱技术在临床微生物检验中的应用

（一）、现代感染性疾病和临床微生物检测现状耐药菌株增多疑难菌株增多现代感染性疾病新特点条件致病菌增多人员少、鉴定速度较慢感染菌种类增多临床微生物当前现状病原生长时间报告时间需氧菌24h2-3个工作日厌氧菌48h酵母菌2-5天2-5个工作日丝状真菌2-5天常规微生物检验遇到的困惑：★呼吸道、肠道标本的细菌种类繁多，常规的鉴定成本高或者操作麻烦，容易漏掉或者忽视某些细菌。★厌氧菌、弯曲菌、分枝杆菌和真菌：细菌鉴定的死角，技术上不好掌握或者目前的方法难以实施。★微生物的分级报告制度：存在很多变数，使得初次报告的结果可靠性得不到临床的认可。（比如：直接涂片，初步能估计细菌大类，但是无法确切的到种，和耐药情况。）实验室要求：操作方便的，成本便宜的，性价比高的，临床迫切需要的。临床微生物实验室自动化将实验室人员从一些技术要求较低的、能由仪器完成的工作中解脱出来，提高标本处理效率，缩短TAT时间。临床的需求……安图生物Autofms1000MALDI-TOF革命性（二）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪MALDI-TOFMS的组成飞行时间质量检测器（TOF）基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）数据库MALDI-TOFMS主机（三）、MALDI-TOFMS的原理基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，从而测得并绘出样品分子的质谱图。4000m/z80004000m/z8000BurkholderiacepaciaRaoultellaornithinolyticaStaphylococcusaureusPantoeaagglomeransAcinetobacterlwoffiEscherichiacoli不同菌种的蛋白指纹图谱不同菌种的蛋白指纹图谱成团泛菌洛菲不动杆菌洋葱伯克氏菌鸟氨酸拉乌尔菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌（四）、操作简便样品靶板细菌与基质飞行管检测器质谱图真空系统样品靶板入口几秒钟即可得到结果基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)MALDI-TOFMS蛋白质指纹特征MALDITOF检测挑取部分菌落点样至靶板加基质液生成图谱搜库鉴定质谱检测流程鉴定结果显示绿色并且分数最高的为该样品的鉴定结果。与现有传统的鉴定诊断技术相比，具有操作简单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好、试剂耗品非常经济等优势。准确度时间成本MALDI-TOF90%5min2元常规方法80%5~48h50元对临床的意义：分级报告，缩短了TAT时间，尤其是厌氧菌、奴卡菌等非常难鉴定的菌提供巨大的帮助。五、实现血培养的三级报告微生物诊断技术不断发展给临床带来了什么？1、非培养/难培养微生物的检测能力大大提高2、缩短了常规微生物培养鉴定诊断药敏时间(即TAT时间)3、从微生物检验角度提供精准的诊断六、安图微生物质谱Autofms1000的优势1、本土产品维护保养方便及时试剂、耗材供应及时价格便宜数据库主要包含：474个属、2613多种、9531株（包含细菌、真菌等）正在开发的数据库：生物反恐、肠道微生物、海洋致病微生物、肉类蛋白数据库……操作简便中文界面，单个软件即可完成编辑、采集、鉴定；快速鉴定功能方便使用。准确度高，重复性好上海临检中心评估项目总结：01ATCC标准菌株鉴定准确性安图质谱检测微生物的结果与172株ATCC国际标准菌株的一致性为97.67%，高于布鲁克的93.60%。02临床菌株鉴定准确性安图质谱Autofms1000对176株临床菌株的鉴定准确性为100%，高于布鲁克的98.30%。04鉴定重复性安图质谱Autofms1000对65株实验菌株的鉴定结果全部可靠，重复性较好。03不同前处理方法的鉴定准确性三种前处理方式安图质谱Autofms1000的鉴定准确性均高于布鲁克质谱，其中甲酸裂解法更适于临床使用。Autofms1000鉴定结果准确、可靠，适于临床微生物检测。中国检验检疫科学研究院评估结论Autofms1000鉴定结果准确性、重复性可靠MALDI-TOFMS对血培养阳性样本的直接检测优点：快速。缺点：操作麻烦，且抽滤容易产生气溶胶，污染环境。不易于在临床推广。鉴定的缺陷：多重菌感染不能鉴定，或者鉴定有误，链球菌等难于区分的菌是最大的问题。MRSA的鉴别和分型[Edwards-Jonesetal.JMedMicrobiol.2000]MRSA的鉴别和分型[Woltersetal.IJMM.2011]从图中可见，可以做同源性的比较使用体会成本低，快速，鉴定结果准确，性价比高。可以聚类分析，即同源性的研究，在耐药上有优势。可以建立库中没有的细菌的数据库，有地域性的数据库。最好选择血平板上的菌落，含指示剂的平板容易降低检出得分，鉴定准确性受影响。质谱技术的局限性1、样品必须单一、纯净2、对某些相似性高的菌种无法鉴定到种水平或出现错误3、某些菌只能鉴定到属的水平，不能鉴定到种或亚种结束语：质谱技术虽然现在仍有一定的缺陷，但在目前仍不失为微生物检验中的最先进的技术。它的广泛应用必将引发微生物检验技术的革命性突破！感谢聆听！