肿瘤细胞凋亡放射性探针研究进展

肿瘤细胞凋亡放射性探针研究进展复旦大学附属肿瘤医院核医学科章英剑细胞凋亡的意义细胞凋亡是在生理或病理状态下，经过一系列基因调控而发生的细胞程序性死亡。细胞凋亡与多种疾病的发生有关，并在疾病的早期诊断、治疗监测和预后中有着重要的作用。细胞凋亡异常在肿瘤发生、发展过程中起重要作用，并影响肿瘤转移及预后。许多化疗药物及放射治疗就是通过使靶细胞发生凋亡而发挥作用。细胞凋亡的途径•死亡受体途径（外源性途径）死亡受体是细胞膜上的一种能与相应配体特异性结合的受体，能够通过一系列基因调控启动细胞凋亡程序，最终导致细胞死亡。死亡受体与其配体结合后通过其它多种分子的共同作用相继激活一系列caspases。•线粒体途径（内源性途径）在凋亡诱导因素的作用下，细胞色素C等物质被从线粒体释放到胞浆中，在相关因子协同下，相继激活各种caspase。•Caspases：半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinasparticcidspecificproteases)。8、9是“启动者”，3、6和7是“执行者”•PS：磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine）•凋亡的早期特征主要有PS外翻、Caspases激活、线粒体膜电位改变等，各种分子探针均主要针对这些特征。细胞膜上磷脂分布不对称性内膜：磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）和磷脂酰乙醇胺外膜：磷脂酰卵磷酯和鞘磷脂细胞凋亡时PS分布：内膜外膜膜联蛋白（主要代表物是AnnexinⅤ、AnnexinB1等）能和PS特异性结合Blood，1997;89:1121–32细胞凋亡的检测方法非肿瘤肿瘤细胞模型处死后获取标本活体显像细胞凋亡的病理检查•细胞固缩、染色质浓集、凋亡小体形成及细胞核DNA规律性降解为主要特征，通常不会产生炎症反应。小动物活体显像方法FromSiemensandDr.WuZhanhong小动物活体分子影像学方法比较光电倍增管晶体准直孔小动物PET/CT介绍2.5mm3.0mm1.5mm2.0mm1.01.251.52.02.50.8小动物PET/CT高分辨、高灵敏方法优点缺点形态学观察光学显微镜观察简便可行缺乏特征性，主观性较强，重复性差视频时差显微技术动态观察，可判定不能用于病理组织培养中的凋亡细胞电子显微镜观察检查凋亡小体的“金标准”不能定量分析，样品制作过程较复杂，费用昂贵细胞化学测定流式细胞仪定量分析适于大批量、定量检测易漏检、错检酶联免疫吸附法核小体测定灵敏度高不能精确定量DNA琼脂凝胶电泳法特异性“阶梯(ladder)小带”灵敏度低,半定量，不能组织原位检测DNA裂解的原位检测用于原位标记,可用于病理非特异性,易受坏死细胞干扰组织;进行定量分析;灵敏度较高活体分子功能成像核素示踪技术早期、无创、高灵敏、可定量将核素示踪剂引入活体磁共振技术无创、可定量灵敏度低，不能早期探测超声检测技术简便，可连续监测不能早期探测光学与生物发光成像可实时监测受活体脏器或组织深度影响AnnexinⅤ国内外研究动态•正电子核素（PET显像）：碳[11C]、氟[18F]、铜[64Cu]、碘[124I]、锝[94mTc]]等•单光子核素（SPECT显像）：镓[68、67Ga]、碘[123I]、碘[125I]、碘[131I]、铟[111In]、锝[99mTc]等•标记方法直接标记：间接标记：通过中间物N2S2、HYNIC、MAG3、iminothiolane、EDDA、EC、MBP、tricarbony、SDH、BTAP等凋亡研究模型和诱导方法-99mTc-HYNIC-AnxV•ApoptosiswasinducedinisolatedhumanPMNsbyincubationin2%salinefor17~22hat37℃AbscesseswereinducedinmicebyintramuscularinjectionofbacteriaorturpentinePennDL,etal.Apoptoticabscessimagingwith99mTc-HYNIC-rh-Annexin-V.NuclMedBiol.2010Jan;37(1):29-34.17h结合率22h结合率4h%ID/g24h%ID/g凋亡中性白细胞71.6±0.01%74.9±0.02%细菌性脓肿1.25±0.093.75±0.83对照细胞48.6±0.01%47.2±0.02%松香诱导脓肿1.02±0.160.72±0.17•结扎血管，缺血后再灌注心肌梗塞凋亡模型肾脏梗塞凋亡模型•化疗•麻醉发育期大脑脑凋亡模型脑凋亡模型•Onpostnatalday7,ratpupsintheexperimentalgroupwereexposedtosixinjectionsofketamine(20mg/kgat2-hintervals)。•Onpostnatalday35,37MBqof18F-annexinV.•Theuptakeof18F-annexinVwassignificantlyincreasedintheROIofketamine-treatedrats.Additionally,thedurationofannexinVtracerwashoutwasprolonged99mTc-Hynic-rh-AnnexinV在肿瘤疗效检测中的应用来源：Invivoimagingofapoptosisby99mTc-AnnexinVscintigraphy:visualanalysisinrelationtotreatmentresponseKartachovaM,HaasRLM,OlmosRAV，et.alRadiotherapyandOncology72(2004)333–339女，60y，NHL伴左颈部淋巴结肿大，放疗后明显好转。A治疗前，明显淋巴结肿大（白箭头）B为放疗1月后，淋巴结明显缩小C和D示治疗前及治疗后早期99mTc-Hynic-rh-AnnexinVSPECT检查图像，可见淋巴结对显像剂的摄取明显增加（黑箭头）E和F为SPECT/CT融合图像，见淋巴结、唾液腺和颈椎脊髓摄取。男，26y，口咽癌，同期放化疗后部分好转。A为治疗前MR，示舌根部肿块B为治疗后3月MR，肿块明显缩小（白箭头）C和D治疗前及治疗后早期99mTc-Hynic-rh-AnnexinVSPECT检查图像，可见肿瘤对显像剂的摄取明显增加（黑箭头）E和F为SPECT/CT融合图像，可见肿瘤和颈椎脊髓摄取显像剂男，47y，NHL，左侧腹股沟巨大软组织肿块，低剂量放疗后(2×2Gy)效果不明显。A为治疗前，示左侧腹股沟明显肿块B为治疗后1月，示肿块无明显变化。C和D治疗前及治疗后早期的99mTc-Hynic-rh-AnnexinVSPECT检查图像E和F为SPECT/CT融合图像，肿瘤在治疗前后仅轻度摄取显像剂99mTc-Hynic-rh-AnnexinV在神经系统疾病检测中的应用来源：99mTc-HYNIC-annexinVSPECTimagingofacutestrokeanditsresponsetoneuroprotectivetherapywithanti-FasligandantibodyBlankenbergFG,KalinyakJ,LiuL，et.alEuropeanJournalofNuclearMedicineandMolecularImagingVol.33,No.5,May2006中风病人发作后2（3）天DWI（上排）和99mTc-HYNIC-annexinVSPECT（下排）大脑右侧颞叶、顶叶、枕叶的成像比较。DWI图像可见弥漫性均匀高信号区；SPECT图像可见同一区域不均匀的放射性摄取，脉络丛中央为血池显像。同一病人中风发作后3天（急性期）与1个月后（慢性期）99mTc-HYNIC-annexinVSPECT成像的比较，可见右颞叶病灶在3天后放射性摄取较高，一个月后基本消退。脑梗死病人发作后1（2）天DWI和99mTc-HYNIC-annexinVSPECT显像的比较。DWI图像上可见右侧枕叶和左侧小脑半球弥漫性高信号区域（黑箭头），相应区域可见99mTc-HYNIC-annexinV摄取增高。AnnexinB1•膜联蛋白家族的一个新成员，由我国科学家孙树汉教授等首先克隆成功的。同AnnexinⅤ有较为类似的性质。国内已用99mTc标记，利用SPECT初步评价了99mTc-HYNIC-AnnexinB199mTc-AnnexinB1用于凋亡显像的可行性，获得较为满意的结果。但国内外还没有用18F标记AnnexinB1的研究报道。18F-SFB-AnnexinB1合成标记、分离纯化和质量控制体外稳定性异常毒理抗Fas抗体诱导后体外结合率(AnnexinV流式细胞分析验证)药代动力学和代谢分析正常生物分布结扎肾动脉，PET/CT凋亡显像(HE、TUNEL分析验证)本科的研究途径与方法18F-SFB-AnnexinB1制备（1）11MeV回旋加速器富氧水（H218O）18F离子（p,n）反应18F-SFB-AnnexinB1制备（2）用进口和自制合成仪制备18F-SFB•QMA柱上的18F离子被含K222和K2CO3的乙腈水溶液洗脱•蒸干，加入SFB标记前体4-三甲基胺苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐（DMSO）•水解、酸化，C18柱分离，在无水乙腈淋洗下进入自制合成设备•蒸干，加入O-（N-琥珀酰亚胺）N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)•加热，酸化，稀释，过柱，过滤18F-SFB-AnnexinB1制备（3）18F-SFB标记AnnexinB1蛋白•18F-SFB被吹干后，加入AnnexinB1/BBS液标记、振荡、洗涤、浸洗、过滤得到18F-SFB-AnnexinB118F-SFB-AnnexinB1min01020mAU01020304050min01020mAU050100150200250300标记物放射化学纯度高与凋亡诱导细胞结合率高18F-SFB-AnnexinB1显像PET/CT凋亡诱导肾显像、TUNEL、HE染色Acknowledgements•张勇平副研究员•王明伟博士•加速器组张建平、刘红霞、高志麒•医生组程竞仪、徐俊彦、杨忠毅•医生组朱蓓玲、施伟、胡四龙、周敏•学生赵庆•本院病理科、乳腺癌中心实验室和复旦放医所•无锡江苏原子医学研究所•西门子公司等