2019基因定位与基因克隆.ppt

基因定位与基因克隆中山大学中山医学院医学遗传教研室陈争常用基因定位的方法体细胞杂交功能克隆和位置克隆连锁分析家系收集单倍型分析的用途本节重点基因定位（genemapping）用不同方法，将基因定位于一特定染色体的实际位置，并确定基因在染色体上线性排列的顺序和距离基因克隆(genecloning)用一定的方法把不同位点上的基因分离出来基因克隆(genecloning)♣功能克隆♣位置克隆♣候选克隆功能候选克隆位置候选克隆功能克隆(functionalcloning)是先研究相关基因的功能，再定位克隆该基因位置克隆（positionalcloning)是先进行基因定位作图，然后找到来自该定位区的基因并进行克隆功能制图疾病基因疾病制图基因功能功能克隆位置克隆功能克隆功能克隆定位克隆(positionalcloning)ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop年代疾病年代疾病1986慢性肉芽肿瘤Duchenne肌营养不良视网膜母细胞瘤1993Menkes病X连锁无丙种球蛋白血症肾上腺白质营养不良1989囊性纤维变性神经纤维瘤Ⅱ型1990Wilms瘤神经纤维瘤Ⅰ型睾丸决定因子(TDF)无脉胳膜症Huntington病VonHippel-Lindou病脊髓小脑性共济失调Ⅰ型Wilson病1991脆性X综合征家族性结肠息肉症Kallmann综合征无虹膜症1994结节硬化症多囊肾病1型Wiscott-Aldrich综合征早发性乳腺癌/卵巢癌(BRCA1)1992肌强直性肌营养不良Lowe综合征先天性肾上腺发育不良用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因年代疾病年代疾病1995点状软骨发育不全肢带肌营养不良眼白化病毛细血管扩张性共济失调Alzheimer病(14号染色体)Alzheimer病(1号染色体)低磷酸盐血性佝偻病遗传性多发性外生骨疣Bloom综合征1996Friedreich共济失调进行性肌阵挛癫痫长QT综合征(11号染色体)Werner综合征X连锁视网膜色素变性(RP3)多囊肾病2型基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常血色病Chediak-Higashi综合征青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12号染色体)定位候选克隆GDB或GenBank已知的基因或EST与疾病关系确定致病基因候选克隆(candidatecloning)GDB或GenBank已知基因已定位的疾病与该基因关系确定致病基因功能候选克隆候选克隆(candidatecloning)常用基因定位和克隆的方法染色体多态法比较制图法测序法体细胞杂交法原位杂交与荧光原位杂交连锁分析法染色体畸变法全基因组外显子测序体细胞杂交(somaticcellhybridization)又称细胞融合(cellfusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybridcell)。♣病毒诱导的细胞融合——仙台病毒♣化学融合技术——聚乙二醇(PEG)♣电融合技术——电穿孔法体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交异双核细胞同双核细胞合核细胞杂种细胞两个同种的动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双核的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双核的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。HAT选择系统1962,人类HGPRT-1964,小鼠TK-♣H：次黄嘌呤(hypoxanthine)♣T：胸腺嘧啶(Thymidine)♣A：氨基喋呤(Aminopterin)5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸PRPPATPADPPRPP-syn1-氨基-5-磷酸核糖5-PR-1-amine肌苷IMPGMP次黄（嘌呤核苷）次黄嘌呤尿酸AMP腺苷ADA脱氧尿苷脱氧次黄苷鸟嘌呤次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRTHGPRT嘌呤的补救合成途经HPRT－TK－HAT选择系统异双核细胞同双核细胞TK－HPRT－HAT选择系统体细胞杂交TK:chromosome17原位杂交技术原位杂交：利用同位素标记的DNA探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。荧光原位杂交(FISH)：用特殊的荧光素标记DNA探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。13号染色体21号染色体荧光原位杂交技术12p部分三体患者FISH结果患者母亲FISH结果连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁交换与重组减数分裂时，同源染色体会发生交换和重组,两个基因（标记）之间距离越远，出现交换和重组的机会越多；距离越近，机会越少。重组值(recombinationfraction)：是基因定位时两个基因(遗传标记)间遗传图距的量度，即基因(遗传标记)间的遗传距离。根据基因的重组值(H)来计算两位点之间的遗传图距，以厘摩(centimorgan，cM)表示两个遗传座位间有1%的重组率即为1cM，1cM约为1000kbA1A2A2A3A3A4A1A2A1A3A2A2A2A3A4A5A1A3A5A6A2A3A4A6A2A4A1A4A1A2A2A3A3A4A3A5A1A5A1A6A3A4A2A4A1=256bp;A2=258;A3=260A4=264;A5=266;A6=270常染色体显性遗传病STR连锁分析多点连锁定位(multipointlinkagemapping)利用三点交叉法(threepointcrosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确地进行基因定位。其优点是有助于克服遗传标记的信息有限性，在不同家系，不同的遗传标记提供有用信息。ABCabc多点连锁定位子代类型重组位置数目85354795非重组体(A，B)-X-CA–X–(B，C)B–X–(A，C)ABC/abcABc/abcabC/abcaBC/abcAbc/abcAbC/abcaBc/abc三个基因的排列次序：A→C→B遗传距离大约为：A-5.2cM-C-9cM-B大规模全基因组扫描和分型的连锁分析连锁分析与全基因组扫描(genome-widesearch)”策略有表型(遗传性状或疾病)就可以肯定在基因组中有它的基因有基因则在基因组中必有其位置(位点)该位点与基因组中的另一位点(如多态性的遗传标志)之间必有某种联系连锁分析的基本原理：①基因在染色体上呈直线排列，同一染色体上的基因和/或遗传标记形成连锁②位于同一条染色体上的两个位点在减数分裂过程中会发生交换与重组③两个位点之间相距越远,则发生重组的机率就越高,它们一起传给后代的机会就越小遗传图谱上基因或遗传标记位点之间的距离称为图距(mapdistance),通常用摩尔(M)或厘摩尔(cM)表示,它们之间的关系为1摩尔等于100厘摩尔。连锁分析是根据家系中亲代与后代不同基因位点间的基因型估计出它们之间的重组率,然后利用定位函数将重组率转换成以M或cM为单位的图距DNA遗传多态性标志RFLP：分布不均匀，信息量低VNTR：信息量高，用Southern印迹分析STR：信息量高，6-10Kb一个，可用多重PCR分析SNP：信息量低，但分布广，平均1Kb一个，可用自动化分析，现已有1；5；10；50万密度全基因组扫描芯片当发现家系中疾病位点与某个遗传标志之间毫无连锁(重组率=50%)的证据时,则可将其从该遗传标志附近“排除”;如果发现它与某个遗传标志之间有一定程度的连锁(0重组率50%),则知道疾病位点已在该遗传标志附近;如果它与某个遗传标志之间没有重组(重组率=0),而个体数(即减数分裂事件)又达到统计学要求,这时便可知道该遗传标志已经非常靠近疾病位点一、家系的收集与处理用于连锁分析的理想家系:①诊断准确,且为迁移较小、相对封闭的人群②家系的数目及大小需达到一定要求③有明确的遗传相关数据,如遗传方式、遗传度、外显率等疾病家系的选择与评估:①疾病家系越大越好。据一般的经验公式,一个有40多个能提供信息减数分裂事件的三代以上的家系，基本上可得到“肯定连锁”的证据②不管是大家系还是小家系,对每一个体的诊断是至关重要的③注意发病的时间性、治疗效应和发病年龄、发病史V-1V-2V-3IV-1IV-2IV-3IV-4IV-5IV-6IV-7IV-8IV-9IV-10IV-11IV-12IV-13IV-14IV-15IV-16IV-17IV-18IV-19III-1III-2III-3III-4III-5III-6III-7III-8III-9III-10III-11III-12III-13III-14III-15II-1II-2II-3II-4II-5II-6I-1I-2关键个体:I-1,I-2;II-1,II-2,II-3,II-4,II-5,II-6;III-1,III-2,III-3,III-5,III-6,III-7,III-8,III-10,III-11,III-13,III-14,III-15;IV-1,IV-2,IV-3,IV-6,IV-7,IV-8,IV-13,IV-14,IV-15,IV-18,IV-19;V-1能提供参考信息的个体:IV-4,IV-9,IV-10,IV-11,IV-12,IV-16;V-2,V-3应用价值较小的个体:III-4,III-9,III-13;IV-5,III-175代45人32人家系材料的收集与保存：①组织样本：包括血液及血液滤纸片、活检组织及切片、分离的细胞株、毛发、唾液滤纸片等，可在-70℃或液氮中保存②DNA标本：收集到的血液样本应按严格的方法进行DNA抽提和纯化，-20～-70℃中保存③临床资料：临床症状、发病情况、家族史④临床检验结果和家系图家系分析应注意点：①临床资料完整准确②注意外显不全和迟发显性现象③遗传异质性④基因多效性⑤非孟德尔遗传现象⑥X染色体失活现象STR的选择与制备选择STR一般应达到在染色体上平均覆盖5～10cM左右。随后合成扩增这些STR的PCR引物,并分别于其中的每一条引物5’端引入几种不同的荧光染料(如6-FAM、HEX、TET)进行标记。目前商品化的ABIPRISMTMLinkageMappingSet(PE公司出品)共包含400个STR,分辨率10cM,覆盖人类整个基因组，而且杂合度高PCR反应PCR反应于96孔板中进行(现多采用在同一反应管中进行多重PCR反应,使PCR扩增过程更加迅速和方便,而且PCR反应液的制备可由与其它设备配套的机器手完成取样和加样等过程),反应终止后的PCR产物经95℃热变性后即可用于电泳检测电泳检测PCR产物的检测过程是在自动激发荧光DNA测序仪上进行的。当产物在测序胶中进行电泳时,测序仪上的特殊激光探头可激发荧光,并扫描每一泳道的PCR产物分子量大小。同时,与测序仪联接的计算机可直观地将每一产物的产量及分子量大小用曲线峰谱表示出来,再用相应的软件系统将电泳检测到的数据进行处理自动基因分型主要是应用GENSCAN和Genotyper软件完成分型步骤:①准确测量每一泳道内的分子量内标,然后依靠内标绘出分子量的回归曲线②进一步确定每个峰的真实性③对各产物做深入的检测从而根据回归曲线确定每一产物的分子量大小,并由此转化为片段长度大小④对产物进行孟德尔遗传模式的校对与检查⑤确定每一产物的基因型并储存起来,以进行下一步的分析基因组扫描综合分析经上述处理后的数据输入相应的软件(如LINKAGE等)进行Lod值的计算,并与家系分析得出的数据进行综合处理,从而得出每一个微卫星遗传标志的两点连锁分析Lod值和多点连锁分析Lod值LOD值(LOD-score)法又称优势对数法，最初由Haldane和Smith(1947)在分析人类控制色盲和血友病的性连锁基因的重组率时提出。现在广泛应用于遗传标记之间或遗传标记和单基因控制的质量性状之间连锁分析。LOD值法实际上是一种最大似然分析方法,只是在求解重组率的最大似然值时不用常规的数值迭