组培实验室的设计

第一章植物组织培养实验室构建第一节：商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备主要内容：•实验室的设计•仪器设备和器皿用具在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。一、实验室设计组培实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。组培实验室组成：•标准组织培养室包括:•洗涤室（区）•制备室（区）•灭菌室（区）•储放室（区）•操作室（区）•培养室（区）•观察室（区）•药品室（区）▼可以根据自己的实际条件进行合并•准备室：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器.•洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。卧式灭菌锅•无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。接种室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1～2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室应设有缓冲问，面积1m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。超静工作台酸度计培养室：•培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。培养材料放在由金属制成培养架上培养。培养架一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架高1．7m左右。其长度根据日光灯长度而设计，如采用40W日光灯，则长I．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在20—27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%～80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。细胞学实验室该室用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。小型仪器设备有：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。显微镜显微镜玻璃器皿及用具•玻璃器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等；显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。•微孔过滤器（细胞过滤器）：激素用于灭菌。•一般用石棉滤膜第二节：培养基及其配制主要内容：•培养基的成分•培养基的种类、配方及其特点•培养基的配制1、培养基母液的配制2、培养基的配制一、培养基的成分•大量元素•微量元素•氨基酸和有机附加物•植物激素（植物生长调节剂）•维生素类•凝固剂大量元素（以Ms培养基为例）序号化学式化学名称用量mg/l1KNO3硝酸钾19002NH4NO3硝酸铵16503KH2PO4磷酸二氢钾1704MgSO4.7H2O硫酸镁3705CaCL2.4H2O二氯化钙440微量元素（以MS培养基为例）序号化学名称化学式用量（mg/l)1碘化钾KI0.832硼酸H3BO36.23硫酸锰MnSO4.4H2O22.34硫酸锌ZnSO4.7H2O8.65钼酸钠Na2MoO4.2H2O0.256硫酸铜CuSO4.5H2O0.0257氯化钾CoCL2.6H2O0.025氨基酸和有机附加物（以MS培养基为例）序号化学名称化学式用量(mg/l)1肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸NH2.CH2.COOH23盐酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55烟酸NC5H4COOH0.5植物激素（植物生长调节剂）•1、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。•2、细胞分裂素类：KT，6-BA，ZT等。•3、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等•4、脱落酸：ABA•5、乙烯•6、PH值：5.6-5.8培养基的种类、配方及其特点•按性质分•基本培养基：MS、MT（MurashigeandTucher）White•完全培养基基本培养基＋其它成分（激素、有机物质等）•按状态分固体培养基；液体培养基。•按作用分：诱导培养基；增值培养基、生根培养基。•按培养过程分：初代培养基、继代培养基。培养基配方及特点•参见课本p17~18培养基的配制•母液（储备液）的配制与保存•培养基配制Ms母液（储备液）的配制与保存成分用量(g/l)每升培养基取用量(ml)母液1（大量元素）NH4NO3KNO3MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCL2.6H2O８２.５９５.０１８.５４４.０１７.００.０８２０.６２２.２３０.８６０.０２５０.００２５０.００２５２０１０１０１０成分用量（ｇ／ｌ）每升培养基用量（ｍｌ）母液3（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O２.７３２.７８１０母液4（维生素、氨基酸）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸１０.００.０５０.００１０.０５０.２１０培养基的配制1、在洁净的不锈钢锅里放入750ml蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。2、加入储备液1－４０ｍｌ，储备液2、３、４各１０ｍｌ，按需要量加入植物激素。3、用蒸馏水定容到1L。4、调ｐH值。ＰＨ一般５.８5、培养基的分装。6、包扎。7、培养基的高压灭菌。培养基的灭菌•高温高压蒸汽灭菌：121℃，1.1Kg/c㎡，15-20芬，时间过长，培养基成分易变性失效•过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类第三节：外植体的选择与培养主要内容：•外植体的选择•外植体的灭菌•外植体的接种和培养•外植体的成苗途径•污染的原因及预防措施•外植体的褐变及其防止措施•培养物的玻璃化现象及其预防措施一、外植体的选择1、外植体（Explant）：是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。2、外植体选择的要求•选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加实用性。•选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。•选择合适的大小：根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm之间。•选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料外植体的类型1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。二、外植体的灭菌外植体的消毒是组培成功与否的第一关键步骤。•外植体的预处理：对外植体进行修整,去掉不要的部分,在流水下冲洗干净.•外植体的表面灭菌：原则：充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样常用灭菌药剂的使用和效果消毒剂使用浓/%清除难易消毒时/min灭菌效果次氯酸钠2易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好漂白粉饱和溶液易5-30很好升汞0.1-1较难2-10最好酒精70-75易0.2-2好过氧化氢10-12最易5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸银1较难5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60较好常用的灭菌方法•(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次•（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养•（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次•（4）花药的消毒：自来水冲洗70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次消毒注意事项•表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。•在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。•与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。•若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。•HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。三、外植体的接种和培养（一）外植体的接种------无菌操作•是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。外植体接种全过程酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿酒精擦拭旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞修剪外植体（二）外植体的培养•1、光照•2、温度•3、湿度•4、氧气•愈伤组织途径：外植体的成苗途径试管苗外植体愈伤组织根、芽芽芽根如安祖花的组织培养就属此类途径•器官发生途径：外植体经诱导后直接形成根和芽，进而形成完整的植物体。如茎尖培养。•胚胎发育途径：外植体胚状体（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期、子叶期）试管苗•50年代末期，Steward等人从胡萝卜的韧皮部用液体培养基通过游离细胞的分化，获得了胚状体。据统计，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物已达117种，分属43科，75属。•培养基的激素成分和氮源影响胚状体的发生。有的植物可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼陀萝、水稻、小麦花药培养；有的植物需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、酸枣、桃等。•在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。五、污染的原因及其预防措施1、污染：植物组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象2、污染的原因•一是病原菌污染（细菌、真菌）•二是外植体、培养基、培养器皿带菌•三是操作人员未遵守操作规程。真菌污染污染的预防措施组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有：•防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施；•防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌；•操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌等；•操作人员要按照操作程序进行。