米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析

米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析一、米曲霉固态培养基配方设计•设计目的：•本实验中需要培养的菌种为米曲霉。米曲霉是一种好气性真菌，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子球形平滑，少数有刺。培养适温为37℃。根据参考文献及其考虑到实验室菌株的差异性，我们的配方为：•麸皮：豆粉=4:1麸皮：葡萄糖=9:1•60%水（7.5ml）自然pH•每100g接种10*10^8个孢子，培养30℃，48h。m(麸皮):m(豆粉)单位酶活相对酶活1：41048.862.62：3123.373.43：21676.0100.04：12401.3143.65：02308.5137.7•根据表中，4:1时酶活力最高，随着豆粕的含量增高，酶活下降。可能原因是豆粕为粉状而麸皮为薄片状，米曲霉为好氧菌，透气性越好则生长越好，酶活越高。•从另一文献中发现有加葡萄糖，活力也得到显著提升，考虑到菌株的差异，以m(麸皮):m(豆粕)=9:1尝试加入。参考文献:•[1]赵飞龙，徐亚军.米曲霉的应用研究进展[J].中国酿造.2006,3:8-10•[2]杨世平，邱德全.米曲霉产中性蛋白酶的适宜条件[J].湛江海洋大学学报.2005,25(3):47-51•[3]邓倩，林亲录，赵谋明，周俊清.米曲霉M3产高蛋白酶特性研究[J].中国调味品.2005,1:16-20其他因素的影响•1、培养基的含水量•由表已知：当水加入7.5ml,即60%时，总酶活最大。加水量/mlW(水)%单位酶活相对单位酶活总酶活相对总酶活2.533.3680.545.7510334.35501489.210014892100.07.5601414.295.017681118.710.066.71110.274.616653111.812.571.4328.221.85745.338.6•2、培养基起始pH值•由表知我们培养基起始pH范围为6-7，pH=6.0时酶活最高pH相对酶活5.063.76.0100.06.587.07.076.48.059.29.052.2•综上所述，米曲霉产中性蛋白酶的适宜培养条件为:•m(麸皮):m(豆粕)=4:1可用8g:2g•水50%，即10ml•pH=6我们小组的加样配方为：•①m(麸皮):m(豆粕)=4:18g:2g水10ml•②m(麸皮):m(豆粕)=3:26g:4g水10ml•③m(麸皮):m(豆粕)=2:34g:6g水10ml二、实验过程•1、米曲霉的培养•实验室保藏的米曲霉菌种→接种斜面，30℃恒温培养3-5d→新鲜斜面加无菌水制成孢子悬液→吸取一定量的孢子悬液接种到固态培养基(250ml三角瓶)中→30℃恒温培养3d成曲(每培养8-12h摇瓶1次)•2、蛋白酶活力的测定•(1)成曲水分含量的测定：准确称取1.0000g左右的研细的成曲于称量瓶中(预先称好空瓶重量)，置于105℃干燥箱中烘至恒重(大约2h)，取出在干燥器冷却后准确称量，计算水分含量。•(2)称取一定量(5g左右)充分研细的成曲，按加水比1:20(约100ml)加入蒸馏水，40℃水浴内间断搅拌1h，滤纸过滤，滤液即为粗酶液，用量筒准确测量粗酶液的体积V(ml)。取少量用0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲液稀释一定的倍数后测酶活力。•(3)蛋白酶活力的测定:每份粗酶液取大试管2支，编号，每管先加入稀释的粗酶液1ml，40℃水浴中预热2min，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min。时间到后，各管立即加入0.4mol/L的三氯蜡酸2ml，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后过滤收集滤液于小试管中。另取大试管2支，编号，每管内加入滤液1ml，再加入0.4mol/L的碳酸钠5ml，已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20min，用分光光度计测定OD660，(先用蒸馏水校零)。•空白试验也取大试管2支，编号，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L的三氯蜡酸2ml，使酶失活，40℃保温20min后再加入1ml酪蛋白保温10min。实验图片研细成曲过滤得粗酶液40℃水浴1h加入酪蛋白，一定时间后加入三氯蜡酸终止反应水浴保温20min后再次过滤到小试管中•3、计算•在40℃下，每min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义一个蛋白酶活力单位(U)•样品蛋白酶活力单位(干基)=[4*V*n*A]/[10*m*(1-W)]U/g干基•式中•A:由样品测定OD660值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(ug)•V:粗酶液体积(ml)•4:4ml反应液取出1ml测定(即4倍)•n:酶液稀释倍数•10：反应10min•W:样品水分含量(%)•m:称取成曲的克数•A由y=0.0098x+0.002计算而得，其中y为OD660值，x为酪氨酸浓度(ug/ml),A=x=(y-0.002)/0.0098①m(麸皮):m(豆粕)=3:2时，y=(0.388+0.396-0.135-0.141)/2=0.254,代入上式得A=x=25.71V=82mln=10W=52.28%m=5g样品蛋白酶活力单位(干基)=[4*V*n*A]/[10*m*(1-W)]=[4*82*10*25.71]/[10*5*(1-52.28)]=84328.8/23.086=3652.81(U/g)②m(麸皮):m(豆粕)=2:3时，y=(0.426+0.422-0.130-0.136)/2=0.291,代入上式得A=x=29.49V=80n=10W=56.08m=5g样品蛋白酶活力单位(干基)=[4*V*n*A]/[10*m*(1-W)]=[4*79*10*29.49]/[10*5*(1-52.06%)]=93188.4/23.97=3887.71(U/g)③m(麸皮):m(豆粕)=4:1时，y=(0.441+0.436-0.125-0.124)/2=0.314,代入上式得A=x=31.84V=79n=10W=52.06m=5g样品蛋白酶活力单位(干基)=[4*V*n*A]/[10*m*(1-W)]=[4*80*10*31.84]/[10*5*(1-56.08%)]=101888/27.04=3768.05实验数据OD660样品空白①空白②样品①样品②称量瓶(g)称量瓶+湿基(g)称量瓶+干基(g)含水量(%)粗酶液体积(ml)粗酶液稀释倍数酶活力(U/g干基)粗酶液一3:20.1350.1410.3880.39636.441435.450034.922752.2582103652.81粗酶液二2:30.1300.1360.4260.42232.387933.386232.866552.0679103887.71粗酶液三4:10.1250.1240.4360.44133.104234.106333.563456.0880103768.05讨论与思考•从上表可以看出，当m(麸皮):m(豆粕)=2:3时，酶活力最高，为3887.71而比例为4:1时为3768.05,3:2时为3652.81.•而根据文献资料可知，4:1时应该酶活最高，且这三个比例的酶活应为4:13:22:3•导致这个结果的原因可能是粗酶液加入水浴锅的时间不一致，使得反应时间有一组较其他两组要稍长，从而ODD660值偏大，则酶活也偏大(样品蛋白酶活力单位(干基)=[4*V*n*A]/[10*m*(1-W)])•同时也不排除其他因素，如实验误差，实验配方与文献配方并不完全一致，以及含水量是否准确等。•思考题：1、常规酶活测定程序为：当酶液适当稀释，在最适条件下进行酶促反应，测定反应量，根据酶活单位定义计算酶活力。上述过程中，哪个阶段的操作失误给实验结果造成的影响最大？如何防止？最适条件下进行酶促反应过程对实验结果影响最大，在实验中，应准确控制反应温度，溶液pH，以及反应时间，并多次测量求平均值。2、试验中加入碳酸钠的目的是什么？福林试剂在碱性条件下，被酚类物质还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定条件下，蓝色深度与酚的量成正比。所以碳酸钠主要提供碱性环境。3、蛋白质与Folin-酚试剂也可以显色，实验中如何排除为水解蛋白质对测定结果的干扰？可设置对照组，测得蛋白质与福林试剂反应溶液的OD660值，在实验组结果中减去。