生物技术 第二章 载体(2学时)概要

第二节基因工程载体2载体在基因工程中的必要性•目的外源DNA很难进入受体细胞•目的外源DNA一般不带复制子系统•目的外源DNA一般不具备表达的调控系统3•概念vector：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。•化学本质是DNA•功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件A、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存B、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接(多克隆位点)C、具有某些标记基因，便于进行筛选，经常使用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒(具有遗传表型或筛选标记)⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段⒌可导入受体细胞。质粒严紧型质粒（相对质量较大，1—2个）松弛型质粒（相对质量较小，20个左右）运载体必须具备以下条件：基因克隆常用的载体质粒载体大肠杆菌质粒载体PBR322枯草杆菌质粒载体PNC3酵母菌质粒载体农杆菌Ti质粒载体Ti噬菌体载体噬菌体载体Cos噬菌体载体病毒载体SV40病毒载体乳头瘤病毒载体一常用的克隆载体1.质粒（plasmid）：一般特征•质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。•广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。•它是一种裸露的比病毒更简单，有自主复制能力的DNA分子。⑴分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高(松驰型质粒拷贝数较多)。⑵具有遗传标记：如抗生素性基因;—半乳糖酶基因（LacZ）⑶具有多个酶的单一切点。称多克隆位点（multiplecloningsites,MCS如PBR322(人工合成)4.3Kb：含AmP(氨卞青霉素)、Tet(四环素)24个单一切点质粒种类很多，但作为克隆载体须具备:指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。P29穿梭质粒载体：质粒的不相容性pBR322质粒pBR322质粒①4363bp②含一个复制点DNA复制起点ori,③含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).sensitive敏感质粒的构建质粒携带外源基因12pBR322•质粒载体pBR322是一个使用非常广泛的质粒载体，但它带的多克隆位点较少，筛选程序较麻烦。lacZ基因：未重组的质粒转化宿主菌后，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。然而当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子。15pUC19克隆载体•筛选方法：除了氨苄青霉素抗性筛选外，培养基中还加入IPTG、氨苄青霉素、X-gal，若菌落颜色为蓝色，表明未整合，若为白色，说明整合了目的DNA。•适合克隆2kb以内的序列(二)λ噬菌体最大容量：大肠杆菌T2噬菌体蝌蚪形噬菌体结构模式图噬菌体(phage)：感染细菌的病毒称为噬菌体。装载容量：较大片断DNA，从6-8kb、10-20kb、30-45kb不等λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为λ噬菌体DNA的75%～105%噬菌体吸附吸附是噬菌体与菌体表面受体发生特异性结合的过程，其特异性取决于噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性。λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为λ噬菌体DNA的75%～105%•基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。•DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂时，释放噬菌体。溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。**只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。λ噬菌体感染细菌后的两种生长途径:噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点（cohensive-endsite):互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。:噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。溶菌性生长溶源性生长λ噬菌体两种生长途径（示意图）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。非必需区λ噬菌体克隆载体的构建策略*切去部分或全部非必需区，保留该酶的1个或2个识别位点作为克隆位点，并且用点突变或甲基化酶处理方法使必需区内的该酶的识别序列失效，避免外源DNA片段的插入；*可在非必需区组入选择标记基因；*36.4kb—51.5kb噬菌体：感染细菌的病毒根据生活周期分⑴特点①双链DNA分子（线性或环形）②两端具有12个bp单链互补粘性末端③具非必需区（中间区约1/3长度）④可在E.Coli中大量繁殖⑤可克隆36.4kb—51.5kb左右的外源基因⑵λ噬菌体载体的类型•两种类型：①置换型②插入型置换型载体：可被外源DNA置换的λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类λ噬菌体载体称插入型载体。外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应。如：—半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选）编码三、柯斯质粒•1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。•柯斯质粒（cosmid）=cos序列+质粒。实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。(三)粘性质粒(cosmid,cossite-carryingplasmid)粘性质粒（Cosmid）：柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记,加上λ的cos位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆。*由DNA的Cos区与质粒构建,即质粒DNA接上λ噬菌体粘性末端(cos,cohesive).*环状双链DNA，结合质粒克隆载体和λ噬菌体克隆载体的优点．◆具有λ噬菌体粘性末端特性，带Cos区，可进行体外包装◆具有质粒耐药性标记如Amp，Tet◆具有多个限制性酶切位点◆具有高容量的克隆能力◆接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，就能在真核细胞中存在和表达．特点：与噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。(四)酵母载体(yeastvector)：略•酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)：可接受2Mb的外源DNA插入，是人类基因组计划物理图谱绘制采用的主要载体（五）病毒载体(virusvector):略•作用：在真核细胞或者哺乳动物细胞中表达外源基因。•种类：•昆虫杆状病毒载体（真核细胞表达常用）；•SV40病毒载体；•逆转录病毒载体（转基因常用）；•腺病毒载体（稳定表达）；•痘苗病毒载体等。自我扩增型载体（self-amplifyingvector）：这类载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和SemlikiForest病毒为基础的。用目的基因代替病毒的外壳蛋白编码序列，导入靶细胞中，病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组，mRNA水平的大量增加导致高水平的转导基因表达。自我扩增型载体的表现形式可以是RNA，DNA和重组病毒。条件增殖型病毒载体（conditionallyreplicatingvector）：指可在某种特性的组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖的病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺病毒突变株Onyx-015是55KdalE1B基因功能缺失的腺病毒突变株，可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖，而在正常组织细胞中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤II期临床结果令人鼓舞（KirnDetal.1998），已进入III期临床试验，从此，许多人工改造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。嵌合型病毒载体（hybridviralvector）：指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性（双链线状DNA），又具有AAV病毒的染色体整合性（LieberAetal.1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（JohnstonKMetal.1997）、腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（TanBTetal.1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（CaplenNJetal.1999）等，不一而足。这些杂合载体使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。（六）农杆菌Ti质粒载体：P29略•它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。•PUC质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件(ABCD)•A.AmPrB.ori复制子C.LacZ标记D.多克隆位点在含某个基因的载体中，将目的基因DNA片段插入该基因，导致该基因的功能失活如：抗性基因的插入失活筛选，含Tetr和Ampr基因的载体，若将目的基因插入Tetr基因，导致Tetr基因失活，形成重组质粒Tets和Amps随堂闯关随堂闯关•插入失活•下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是：（C）•A．染色体只存在于真核生物细胞中，质粒只存在于原核生物细胞中•B．在基因工程中染色体和质粒均可以作为运载体•C．染色体和质粒均与生物的遗传有关•D．染色体和质粒的化学本质相同随堂闯关随堂闯关•10.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一BglI的切点。现用BglI切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?（6分）•（1）Tetr（2分）;（2）TetrandKans（２分）；（3）在含有Tet和Kan中不能生长的重组子，却能在仅含有Tet的生长的为理想的重组子（２分）。随堂闯关随堂闯关•天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？•（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。•（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。•（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。•（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。•（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。随堂闯关随堂闯关•自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE