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第六章微生物的生长繁殖及其控制第一节微生物生长繁殖的测定第二节细菌的群体生长规律第三节影响微生物生长的主要因素第四节微生物培养法概论第五节有害微生物的控制微生物细胞吸收环境中的营养物质,进行新陈代谢,当合成代谢大于分解代谢时,导致细胞重量&体积扩大,即为微生物的个体生长。微生物细胞生长到一定阶段,细胞数量增加,即为微生物的繁殖。个体发展成一个群体,个体进一步生长繁殖就引起微生物的群体生长。生长与繁殖的关系生长是繁殖的基础;繁殖是生长的结果。个体生长→个体繁殖→群体繁殖群体生长=个体生长+个体繁殖研究目标:群体生长评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果;客观地反映微生物生长繁殖的规律;评价培养条件、营养物质等对微生物生长繁殖的影响;第一节微生物生长繁殖的测定单细胞微生物如细菌、酵母菌的个体细胞的增大即细胞物质的增加是有限度的,细胞长大到一定程度就开始分裂繁殖,菌体数量增多。丝状微生物如放线菌、霉菌的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝,通常以菌丝的体积和重量增长(细胞物质量的增加)来微生物生长量的测定方法很多,可以根据菌体细胞数量、菌体体积或重量作直接测定,也可用某种细胞物质的含量或某个代谢活性的强度作间接测定。重量法:微生物湿重、微生物干重蛋白质总量、DNA含量比浊法生理指标法:呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。1、测生长量2、计繁殖数计数法:直接计数、间接计数。适用于一切微生物测处于单细胞状态的细菌、酵母菌;放线菌和霉菌只能测其孢子数根据每个细胞有一定的重量设计的。每个E.coli细胞的干重为2.8×10-13它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。通过测定微生物湿重、干重、蛋白质总量、DNA含量来计算微生物的生长。重量法将单位体积的微生物培养液经离心或过滤后收集,并用清水反复洗涤菌体,经常压或真空干燥,干燥温度常采用105℃、100℃或红外线烘干,也可在较低温度(80℃或40℃)下真空干燥,然后精确称重,即可计算出培养物的总生物量。过滤时丝状真菌用滤纸过滤,细菌用醋酸纤维膜等进行过滤。本法适宜于含菌量高,不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件。微生物干重法蛋白质总量=含氮量×6.25细胞总量=蛋白质总量÷(50%~80%(或65%))已知细菌细胞干重的含氮量一般为12%~15%,酵母菌为7.5%,霉菌为6.0%。因此只要用化学分析方法(如用硫酸、高氯酸等消化法)测出待测样品的含氮量,也能推算出细胞的生物量。适用于在固体或液体条件下微生物总生物量的测定,但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质,缺点是操作程序较复杂,一般很少采用。蛋白质总量DNA是微生物的重要遗传物质,每个细菌的DNA含量相当恒定,平均为8.4×10-5ng.DNA含量是测定悬液中细胞数的快速方法。原理:根据在一定的浓度范围内,菌悬液的细胞浓度与液体的光密度成正比,与透光度成反比。菌数越多,透光量越低。因此,可使用光电比色计测定,通过测定菌悬液的光密度或透光率反映细胞的浓度。特点:快速、简便;但易受干扰。比浊法生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。样品中微生物数量愈多或生长愈旺盛,这些指标愈明显,因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。生理指标法利用特定的血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数缺点:直接计数不能区分死菌和活菌。需要相对高的细菌浓度.各种型号的全自动血球计数仪又称活菌计数法,其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成一个菌落。间接计数每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则,以平板菌落数在30~300之间为报告依据。1、平板菌落计数法2、薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜(硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜)过滤,菌体被阻留在滤膜上,取下滤膜进行培养,然后计算菌落数,可求出样品中所含菌数。微生物学一、微生物的个体生长和同步生长二、单细胞微生物的典型生长曲线三、微生物的连续培养和高密度培养第二节细菌的群体生长繁殖由于微生物细胞极其微小,研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念:一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态,称为同步生长(synchronousgrowth),进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相,彼此间形态、生化特征都很一致,因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。一、微生物的个体生长和同步生长化学诱导物理诱导诱导法过滤法区带密度梯度离心法膜洗脱法筛选法同步培养法获得同步生长的方法:获得同步生长的方法主要有两类:环境条件诱导法:变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。筛选法:选择性过滤、梯度离心。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。硝酸纤维素薄膜法(Helmstetter-Cummings)原理:一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤:菌悬液通过微孔滤膜,细胞吸附其上;反置滤膜,以新鲜培养液通过滤膜,洗掉浮游细胞;除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞,即为同步培养。生长曲线的制作:接种适温培养定时取样测定生长量生长曲线的制作将少量单细胞的纯培养,接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中,在适宜条件下培养,每隔一定时间取样,测菌细胞数目。以培养时间为横坐标,以细菌增长数目的对数为纵坐标,绘制所得的曲线。二、典型生长曲线——描述细菌生长规律总菌数活菌数培养时间Ⅱ.指数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滞期细菌数目(个/ml)对数ⅡⅢⅣⅠ思考:为什么微生物生长有此规律?缩短延滞期的意义和方法出现原因本期特点影响本期限长短因素其它名称:停滞期、调整期、适应期延滞期(lagphase)延滞期出现原因原因:适应新的环境条件,合成新的酶,积累必要的中间产物现象:活菌数没增加,曲线平行于横轴。延滞期特点生长速率常数R=0;细胞形态变大或增长;细胞内RNA和DNA含量提高;合成代谢活跃(核糖体、酶类、ATP合成加快),易产生诱导酶;对外界不良条件敏感,(如氯化钠浓度、温度、抗生素等理化因素).菌种:繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短;细菌、酵母菌的延迟期短,霉菌次之,放线菌最长。接种物菌龄:用对数生长期的菌种接种时,其延迟期较短,甚至检查不到延迟期;接种量:一般来说,接种量增大可缩短甚至消除延迟期(发酵工业上一般采用种子:发酵培养基=1:10v/v的接种量);培养基成分:在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短;接种后培养基成分有较大变化时,会使延滞期加长,所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。影响延滞期长短的因素取决于菌种的遗传特性、菌龄及接种前后培养条件的差异等。缩短延滞期的意义和方法在发酵工业上需设法尽量缩短延滞期;采取的缩短lagphase的措施有:①选用繁殖快的菌种②采用对数生长期的健壮菌种;③增加接种量;(群体优势----适应性增强)④调整培养基的成分,在种子基中加入发酵培养基的某些成分。在食品工业上,尽量在此期进行消毒或灭菌微生物学特点该期的细菌多被用做生产中的种子和科学试验材料①活菌数和总菌数接近②酶系活跃,代谢旺盛。③生长速率最大,代时最短。④细胞进行平衡生长,菌体大小、形态、生理特征等比较一致现象:细胞数目以几何级数增加,其对数与时间呈直线关系。指数期(对数期)(exponentialphase)代时(或倍增时间)(G):微生物分裂一次所需要的时间。以二分裂的细菌为代表,假设细菌培养体在对数期t0时的总菌数为X1,那么到t时的菌数Xt=X1×2n;式中n为t0到t这段时间内细菌的繁殖代数。G=(t-t0)/n生长速率常数(R):即每小时分裂次数。温度(℃)代时(min)温度(℃)代时(min)108603522151204017.520904520254047.5773029影响微生物代时长短的因素菌种:原核微生物细胞的生长速率要快于真核微生物细胞,形态较小的真核微生物要快于形态较大的真核微生物。营养成分:同一菌种不同培养基差别大营养物浓度:影响微生物的生长速率和总生长量;生长限制因子。培养温度:影响极大,发酵实践、食品保藏和防止食品变质和中毒8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量生长限制因子:凡是处于较低浓度范围内,可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量①由于此时期的菌种比较健壮,生产上用作接种的最佳菌龄;②发酵工业上尽量延长该期,以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。应用意义:出现原因营养的消耗有害代谢产物积累PH值等理化条件不适营养物比例失调稳定期(stationaryphase)稳定期特点及应用意义新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,微生物的生长速率处于动态平衡,培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降,开始积累内含物,产芽孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物,对于发酵生产来说,一般在稳定期的后期产物积累达到高峰,是最佳的收获时期。衰亡期(declinephase)产生原因生长条件的进一步恶化,使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢,继而导致菌体的死亡①细胞死亡数增加,死亡数大大超过新增殖的细胞数,群体中的活菌数目急剧下降,出现“负生长”。②细胞内颗粒更明显,细胞出现多形态、畸形或衰退形,芽孢开始释放。③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用,使菌体死亡、自溶等,发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长,它的长短也与菌种和环境条件有关。特点微生物的生长曲线,反映一种微生物在一定的生活环境中(如试管、摇瓶、发酵罐)生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标,也可用为调控微生物生长代谢的依据,以指导微生物生产实践。根据发酵目的的不同,确定在微生物发酵的不同时期进行收获,微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。生长曲线的指导意义微生物学丝状微生物的纯培养采用孢子接种,在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养,菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标,即以时间为横坐标,以菌丝干重为纵坐标,绘制生长曲线。可分为三个阶段:1、生长停滞期2、迅速生长期3、衰退期三、丝状微生物的群体生长1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态,另一种是生长已经开始,但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加,其立方根与时间呈直线关系,菌丝干重不以几何级数增加,没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等,此时期的菌体呼吸强度达到高峰,有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降,到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成,大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体,这与菌种和培养条件有关。丝状微生物的群体生长各时期特点单批培养(batchculture):将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养,培养基一次性加入。不再补充和更换,最后一次性收获。连续培养理论基础:由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识,采取相应有效措施推迟其来临,从而发展出现在的连续培养技术。四、微生物的连续培养原理:当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时
本文标题:第六章-微生物的生长繁殖
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