2 分子克隆工具酶

A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的载体C.用于基因转移的受体菌或细胞用于核酸操作的工具酶有哪些？体外重组DNA技术所需的基本条件？基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。基因工程工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶限制性内切酶甲基化酶DNA连接酶DNA聚合酶RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶核酶基因工程工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用第一节限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)一、限制与修饰细菌的限制—修饰作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restriction）现象：E.colikE.coliB【E.coliB限制λ（k）】感染不感染1、限制与修饰现象phageλ(K)寄主控制的专一性噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。R-M系统限制性核酸内切酶(restrictionendonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。2、限制性核酸内切酶的发现限制性内切酶的发现1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。限制性内切酶的发现EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindIIIHindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距5-10bp对基因工程中意义无用非常有用意义不大3、限制与修饰系统的种类二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。二、限制性核酸内切酶识别的序列限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基4个碱基识别位点：Sau3AⅠ↓GATC5个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGGNciⅠCC↓SGG1、限制酶识别序列的长度6个碱基识别位点：EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT7个碱基识别位点：BbvCⅠCC↓TCAGCPpuMⅠRG↓GWCCY8个碱基识别位点：NotⅠGC↓GGCCGCSfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。2、限制酶识别序列的结构识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’ABB’A’ABB’A’或或DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用↓或／表示。3、限制酶切割的位置切割的位点：一般在识别序列内部，如G↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓GG、AGCGC↓T等。少数在识别序列的两侧，如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等3、限制酶切割的位置EcoRⅠ5‘……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’不同核酸内切酶的特异识别位点PstⅠ5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC...…5’3、限制酶切割的位置AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′突出粘性末端。5′－GAATTC－3′EcoRl5′－G－OHP－AATTC－3′3‘—CTTAAG－5’3‘—CTTAA－P+OH－G－5'若在3‘-侧切割，则产生3’突出粘性末端，如PstⅠ：5'—CTGCAG－3'Pstl5'—CTGCA-3'5'—G－3'3'－GACGTC-5'3'—G-5'十3'-ACGT－5'在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。2、限制酶产生平末端粘性末端、平整末端200多种限制性内切酶，切点各不相同。许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbcⅠ,它的识别切割位点如下：CC↓TCAGCGGAGTCG3、限制酶产生非对称突出末端平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）5’-GGCC-3’3’-CCGG-5’5’-GG--CC-3’3’-CC--GG-5’5’粘性末端（如EcoRⅠ）5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-G--AATTC-3’3’-CTTAA--G-5’3’粘性末端（如PstⅠ）三种酶切末端4、同裂酶同裂酶来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。同序同切酶、同序异切酶、同功多位等。同尾酶来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。5、同尾酶5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶难以发挥切割活性。四、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制性核酸内切酶的活性单位20μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。五、位点偏爱（Sitepreference）酶切反应系统应组成：酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的反应温度。六、酶切反应条件II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20-100mlTT37℃1-1.5hr0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量1、缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定PH的缓冲剂、Mg2+、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。六、酶切反应条件2、反应温度大多数酶的标准反应温度37度。3、反应时间通常是小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶量。4、终止酶切的方法EDTA可螯合Mg2+，从而可终止酶切反应；加热。限制性内切酶识别特异性放宽EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。七、星星活性（Staractivity）影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。七、星星活性（Staractivity）抑制星星活性的措施：如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100～150mM（如果不会抑制酶的活性的话），降低反应pH至pH7.0，以及保证使用Mg2+作为二价阳离子。限制性核酸内切酶反应影响因素：温度、缓冲液、时间、反应体积和甘油浓度、DNA纯度和结构等。八、影响酶活性的因素1、底物DNA（1）DNA纯度RNA与E结合影响有效酶浓度；八、影响酶活性的因素（1）DNA样品的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间（2）DNA浓度[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h（3）DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。（4）识别位点及邻近位点特异性序列如：pBR322DNA有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。XmaⅢ切点（CGGCC