免疫原和抗血清的制备

第1次作业1、免疫应答可人为的分为几个阶段？各阶段有何特点？2、免疫系统的组成？3、免疫球蛋白可分为几类？各类免疫球蛋白有何特性和功能？4、补体可通过哪几条途径得到激活？试比较。5、抗原抗体反应有什么特点？6、前带与后带的区别与意义？第八章免疫原和抗血清的制备授课：微生物学与免疫学教研室沈小波（09级检验）概述免疫原抗血清检测抗体：单克隆抗体（杂交瘤技术）多克隆抗体基因工程抗体第一节免疫原的制备一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化三、免疫佐剂一、颗粒性抗原的制备包括细胞、细菌、寄生虫抗原血细胞洗涤，调浓度细菌培养物集菌适当处理寄生虫、真菌破碎纯化抗凝绵羊血2000rpm10min压积红细胞N.S洗涤2000rpm10min压积红细胞三次N.S稀释至106/ml绵羊红细胞二、可溶性抗原的制备和纯化可溶性抗原：包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、酶、补体等。一般需纯化蛋白质免疫化学纯化方法1．组织细胞抗原的制备：清洗剪碎、粉碎离心，取上清捣碎方法：（1）高速组织捣碎机（2）研磨法组织和细胞粗抗原的制备2．组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：细胞破碎膜蛋白Ag、细胞质Ag、核与核膜Ag破碎方法：（1）反复冻融法；（2）超声破碎法；（3）自溶法；（4）溶菌酶处理法；（5）表面活性剂处理法（提DNA常用）组织和细胞粗抗原的制备（1）超速离心法；（2）离子交换层析法；（3）凝胶过滤法；（4）亲和层析法纯化方法：亲和层析常用的有免疫电泳法、免疫双扩散法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法等。常几种方法联合应用。纯化抗原的鉴定：三、免疫佐剂预先或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质称为免疫佐剂。一、佐剂的种类：微生物极其产物：如卡介苗(BCG)、-CSF)。无机化合物：如氢氧化铝、明矾。最常用的佐剂——弗氏佐剂不完全弗氏佐剂：石腊油、羊毛脂完全弗氏佐剂：石腊油、羊毛脂、结核杆菌①增强免疫原性。②增加抗体的滴度。③引起或增强迟发型超敏反应。佐剂的免疫生物学作用第二节抗血清（PcAb）的制备抗原纯化+动物+有效的免疫方案一、抗血清的制备程序（一）、免疫动物的选择①抗原与免疫动物种系亲缘关系越远越好②动物个体:适龄，健康，雄性③抗血清的要求：R型：沉淀反应H型：较难掌握④抗原的选择：某些抗原对某些动物免疫原性极差⑤甾体激素和酶：分别用家兔和豚鼠（二）、免疫方法和途径：再次应答初次应答初次免疫再次免疫天数0714212835421000001000010001001010抗原特异性血清抗体滴度（Log）IgGIgM1．颈动脉放血法：这是最常用的方法2．心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。3．静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。（三）、动物采血法（四）、抗血清的鉴定和保存1、抗血清的鉴定（1）.双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性（2）.双向免疫扩散法测定抗血清效价（3）.抗体的纯度鉴定：SDS-PAGE（1）.4℃保存，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。（2）.－20～－40℃，一般保存5年效价不会有明显下降。（3）.冰冻干燥，封装后可以长期保存，2、抗血清的保存二、抗血清的制备方案举例三、抗血清的纯化与鉴定（一）、抗血清的纯化1、特异性抗体的纯化除去杂抗体有两种方法：（1）．亲和层析法：亲和层析法。（2）．吸附法：用杂抗原吸附。三、抗血清的纯化与鉴定（二）、IgG类抗体的纯化：1．粗提法提取球蛋白：大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。2．离子交换层析法3．亲和层析法4．酶解法制备F(ab‘)2片段：胃蛋白酶第三节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体(McAb)——是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。具有高纯度、高特异性、高产量的优点。二、制备流程—细胞杂交瘤技术1.基本原理：是通过两种细胞的融合而产生单个核细胞，即杂交细胞。该细胞同时保持两者的主要特征。如以免疫小鼠的脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，该细胞既有脾细胞产生特异性抗体的功能，又有瘤细胞可长期在体外传代培养的特点。2.流程：聚乙二醇（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂。三、应用1、临床检测各种病原体、肿瘤抗原等2、检测淋巴细胞的表面标志3、机体微量成分的测定4、抑制器官移植排斥5、治疗自身免疫疾病6、生物导弹7、亲和层析中重要的配体名词解释：免疫原、免疫佐剂。问答题：1.简述免疫原的制备方法。2.动物选择的基本原则有哪些？3.免疫方案设计需要考虑哪些因素？4.抗血清应从哪些方面加以鉴定？如何保存？思考题