13高效液相色谱基础理论PPT

高效液相色谱基础理论天美科技有限公司TechcompLTD.第一章液相色谱基础本章内容：‹液相色谱发展史‹液相色谱理论•分离原理•分类•基本概念•理论模型液相色谱发展史z1906年-色谱法出现z1940's-分配色谱和纸色谱z1950's-气相色谱、薄层色谱、凝胶过滤色谱、梯度洗脱色谱z1960's-商品化液相色谱z1980's-HPLC迅速发展第一章液相色谱基础传统柱色谱传统的柱色谱以重力做为溶剂传输的动力，分离速度慢，效率低，且靠肉眼观察化合物的分离和流出，具有很大的局限性。第一章液相色谱基础分离原理利用物质在两相中分配系数的微小差异，当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，这样使原来的微小分配差异产生了很大的效果，使各组分分离。第一章液相色谱基础液相色谱分类根据分离机制¾吸附¾分配¾离子交换¾亲和色谱根据流动相与固定相极性‡正相‡反相正相色谱法极性固定相，流动相为相对非极性的疏水性溶剂，常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法非极性固定相（如C18、C8），流动相为水或缓冲液，，适用于分离非极性和极性较弱的化合物，它占整个HPLC应用的80%左右。第一章液相色谱基础基本概念和术语h=峰高W=峰宽Wh/2=半峰宽tM=死时间tR=保留时间K‘=容量因子tR‘=相对保留时间K‘=tR‘/tM第一章液相色谱基础死时间的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质.例如：正相色谱常用四氯化碳;反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。选择性系数α第一章液相色谱基础定义)1()2()1()2(''''kkttRR＝α＝(α＞1.5为好)α'可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：)1()2('RRtt＝α进样tR(1)tR(2)选择性系数α改变α的途径✎改变固定相✎改变流动相✎改变温度✎改变样品的本身性质第一章液相色谱基础分离度t0InjectTimetR(A)W1/2AWAWBW1/2BSampleASampleBtR(B)第一章液相色谱基础BAABWWRRSttttR＋－＝)(2不同R值的峰重叠示意图R1.5可以得到基线分离第一章液相色谱基础容量因子k'第一章液相色谱基础‹定义00,tttkR－＝或：溶质在流动相中的量溶质在固定相中的量＝'k‹性质与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素。‹范围0.4＜k'＜20～30容量因子k'‹与R的关系‹改变k'值的方法✎调节流动相的极性pH离子强度等✎梯度淋洗第一章液相色谱基础理论塔板数、理论塔板高度第一章液相色谱基础NLH＝22/54.5⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛hRWtN＝216⎟⎠⎞⎜⎝⎛WtNR＝影响分离度（R）值的因素第一章液相色谱基础不对称因子“Tf”：用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。h进样进样AB0.1h拖尾前伸(A、B如上图所示)通常Tf＝0.95～1.05，若Tf＞2则峰不合格。拖尾的原因：硅胶基质上的Si－OH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带–NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。ABTf＝第一章液相色谱基础线速度：溶剂在柱中移动的速度。mm/sec(L─柱长t0─死时间)H(μm)粗粒如右图所示，用实验可找到最佳的线速度：细粒即图中的A点：u＝1mm/sec此处不用流量而用线速度，是因为流量与柱径有关，而线速度与柱径无关。„请记住不同柱内径的最佳流量：ABu(1mm/sec)柱内径流量线速度5mm1.0mL/min1mm/sec(B奌：u＝2mm/sec)2mm0.2mL/min1mm/sec1mm50μL/min1mm/sec由“1mm/sec”最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一瓶昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一个月才用一并。0tLu＝第一章液相色谱基础第二章HPLC仪器工作原理本章内容：¾HPLC特点¾HPLC系统的组成¾往复活塞泵工作原理¾手动进样器结构及工作原理¾常见检测器HPLC特点又称为“高速液相色谱”或“高压液相色谱”„高速„高效„高灵敏度„高自动化第二章HPLC仪器工作原理HPLC系统的组成„典型高效液相色谱仪„主要部分：„高压输液系统„进样系统„分离系统„检测系统第二章HPLC仪器工作原理输液系统z恒压泵，恒流泵输液系统中的关键部位z柱塞杆z密封圈z单向阀往复型泵工作原理图第二章HPLC仪器工作原理并联式双柱塞往复泵„相消干扰„通常需要阻尼器„增加了单向阀的使用数量第二章HPLC仪器工作原理串联式双柱塞往复泵-减少了单向阀的数量-压缩因子补偿第二章HPLC仪器工作原理梯度模式第二章HPLC仪器工作原理色谱柱作用：色谱是一种分离分析手段，分离是核心，色谱柱是色谱系统的心脏。第二章HPLC仪器工作原理进样阀第二章HPLC仪器工作原理六通阀第二章HPLC仪器工作原理检测器„紫外-可见检测器„二极管阵列检测器„示差检测器„荧光检测器„电导检测器„质谱检测器„其它作用：把洗脱液中组分的量转变为电信号。第二章HPLC仪器工作原理第二章HPLC仪器工作原理紫外检测器原理：朗伯-比尔定律第二章HPLC仪器工作原理紫外检测器适用范围：有紫外吸收的物质。第二章HPLC仪器工作原理第二章HPLC仪器工作原理二极管阵列检测器第二章HPLC仪器工作原理DAD-纯度的检查第二章HPLC仪器工作原理荧光检测器第二章HPLC仪器工作原理示差折光检测器第二章HPLC仪器工作原理