亲子鉴定与个体识别

亲子鉴定的基本原理和方法荣媛[e-mail]武汉大学中南医院检验科&法医司法鉴定所2亲子鉴定发展概况不科学3亲子鉴定与遗传标记亲子鉴定：应用生物学技术方法来检测遗传标记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定，实质是一种特殊的个体识别◆血液细胞表面的标记◆血液蛋白质的标记蛋白质标记DNA标记限制性酶切片段多态性DNA长度多态性（微卫星STR）DNA序列多态性4蛋白标记：红细胞ABO,Ph,MN,Kell,Duffy,P等21个血型系统白细胞HLA-A，-B，-C，-D，-DP，-DQ，-DRDNA标记：RFLP，VNTR，STR，SNP蛋白标记：血清型Hp，Gc,Bf,Tf,C2,酶型PGM，EsD，ACP，GPT遗传标记分类5蛋白质遗传标记（血型检查）由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最早用于亲子鉴定的遗传标记，有ABO、MN、P、Rh等21个血型系统。特点：遗传性状简单，符合孟德尔遗传规律遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响操作简单、重复性好，结果明确6ABO血型检查人的ABO血型是受A,B,O三个复等位基因控制的，O为隐性基因，A、B为显性基因。决定ABO血型的基因型AO,AA,BO,BB,OO,AB等6种，表现型有4种：A型、B型、AB型和O型；根据孟德尔遗传规律，即可计算出孩子的可能血型的概率。7红细胞ABO血型检查孩子的血型不是唯一确定的除了A型血与B型血的人婚配外，其他血型组合都有概率为0的不可能事件只能否定8蛋白质遗传标记检测的局限性对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而得不到理想的结果，不适用于陈旧、微量检材（HLA分型要求采血后16--24小时内必须检验）多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除，准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定存在有生理或病理性变异（如：A，O型血的人受大肠杆菌感染后B抗原的检测可能呈阳性）9DNA分子遗传标记的检测DNA指纹技术（RFLP）：第一代遗传标记PCR分型技术：第二、三代遗传标记的检测(微卫星STR位点和单核苷酸多态性SNP)线粒体DNASNP核内染色体STR101985英国JefferysNature人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为DNA指纹实验程序：基因组DNA的提取限制性内切酶消化酶切电泳分离印迹转移探针制备和标记分子杂交和自显影DNA指纹技术（RFLP）11DNA指纹技术（RFLP）实验结果（DNA指纹图谱）：优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、没有种属特异性12PCR分型技术（现代DNA亲子鉴定方法）PCR扩增序列多态性标记（PCR-SNP分析）PCR扩增长度多态性标记（PCR-STR分型）优点：快速、简便、灵敏、特异，适用于微量陈旧的生物学检材13TAGATAGATAGATAGATAGATAGA12345微卫星DNA，简短串联重复（STR）是一种广泛分布在人类基因组中具有长度多态性的DNA序列。由2-6bp的核心序列头尾相连串联重复构成，通常重复4-60次不等（串珠结构）PCR扩增长度多态性标记14(TTTTA)476bp(TTTTA)4TTTTA81bp(TTTTA)4TTTTATTTTATTTTA91bp(TTTTA)4TTTTATTTTATTTTATTTTA96bp(TTTTA)4TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTA101bp(TTTTA)4TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTA106bp(TTTTA)4TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTA111bpApo(a)基因15STR的特点多态性（Polymorphism）：主要由核心序列拷贝数目即重复次数的变化，产生长度多态性目前国内外最广泛应用的遗传标记多态性信息含量大，准确率高达99.99999%，可用于个体识别扩增片段较短（100-300bp），易于检测，适用的生物检材类型广泛灵敏度高，50pg，对于检材要求不高1617DNA条带、重复次数与遗传的关系18STR等位基因命名等位基因通过PCR产物长度来区分和命名19样本收集DNA提取多重PCRABI3130毛细管电泳结果分析签发报告亲子鉴定（STR检测）的流程20检材的收集血液精液颊粘膜病理切片头发牙齿骨骼组织石蜡包埋组织血痕OnlyaverysmallamountofbloodisneededtoobtainaDNAprofile21样本收集DNA提取多重PCRABI3130毛细管电泳结果分析签发报告STR检测的流程22ORGANICFTAPaperCHELEXBloodstainPUNCHWASHMultipleTimeswithextractionbufferPERFORMPCRPCRReagentsSDS,DTT,EDTAandproteinaseKINCUBATE(56oC)Phenol,chloroform,isoamylalcoholQUANTITATEDNAApplybloodtopaperandallowstaintodryBloodstainVORTEX(NODNAQUANTITATIONTYPICALLYPERFORMEDWITHUNIFORMSAMPLES)WaterINCUBATE(ambient)5%ChelexINCUBATE(100oC)REMOVEsupernatantINCUBATE(56oC)QUANTITATEDNAPERFORMPCRPERFORMPCRCentrifugeCentrifugeCentrifugeCentrifugeREMOVEsupernatantTRANSFERaqueous(upper)phasetonewtubeCONCENTRATEsample(Centricon/Microcon-100orethanolprecipitation)CentrifugeTEbufferFigure3.1,J.M.Butler(2005)ForensicDNATyping,2ndEdition©2005ElsevierAcademicPressDNA的提取23样本收集DNA提取多重PCRABI3130毛细管电泳结果分析签发报告STR检测的流程24多重荧光PCR25D3S1358TH01D21S11D18S51PentaED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POPentaDAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex16kit(PromegaCorporation)ILS600CXRsizestandardCXR(Red)FL(Blue)JOE(Green)TMR(Yellow)PCRproductsize(bp)Figure5.4,J.M.Butler(2005)ForensicDNATyping,2ndEdition©2005ElsevierAcademicPressD3S1358TH01D21S11D18S51PentaED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POPentaDAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex16kit(PromegaCorporation)ILS600CXRsizestandardCXR(Red)FL(Blue)JOE(Green)TMR(Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51PentaED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex16kit(PromegaCorporation)ILS600CXRsizestandardCXR(Red)FL(Blue)JOE(Green)TMR(Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51PentaEAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex16kit(PromegaCorporation)ILS600CXRsizestandardCXR(Red)FL(Blue)JOE(Green)TMR(Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51PentaEAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex16kit(PromegaCorporation)ILS600CXRsizestandardCXR(Red)FL(Blue)JOE(Green)TMR(Yellow)AmpFlSTRIdentifiler™kit(AppliedBiosystems)6-FAM(Blue)VIC(Green)NED(Yellow)PET(Red)D8S1179D21S11D7S820CSF1POD3S1358TH01D13S317D16S539D2S1338D19S433D18S51TPOXVWAAMELD5S818FGAGS500LIZsizestandardLIZ(Orange)AmpFlSTRIdentifiler™kit(AppliedBiosystems)6-FAM(Blue)VIC(Green)NED(Yellow)PET(Red)AMELD5S818FGAGS500LIZsizestandardLIZ(Orange)26样本收集DNA提取多重PCRABI3130毛细管电泳结果分析签发报告STR检测的流程27LaserInletBufferCapillaryfilledwithpolymersolution5-20kV-+OutletBufferSampletrayDetectionwindow(cathode)(anode)DataAcquisitionSampletraymovesautomaticallybeneaththecathodeendofthecapillarytodelivereachsampleinsuccessionFigure12.3,J.M.Butler(2005)ForensicDNATyping,2ndEdition©2005ElsevierAcademicPress扩增产物电泳和检测在ABI基因分析仪上完成28ABI遗传分析仪家族293130遗传分析仪的正面结构30技术核心（电泳与检测同时进行）毛细管电泳技术：PCR产物片段越长，迁移越慢，到达荧光检测窗口所需要的时间越长荧光检测技术：CCD（将收集到的荧光信号转换为电信号传输入电脑）遗传分析仪的基本原理31355075100139160200250300340350400450490500150DNAfragmentpeaksinsampleDNASizeDataPoint147.32bp165.05bp100139150160200250DNAfragmentpeaksaresizedbasedonthesizingcurveproducedfromthepointsontheinternalsizestandard(a)(b)32AutosamplerTrayPumpBlockcapillaryDetectionwindowSyringefilledwithPOP-4polymerInjectionelectrodeHeatedplatefortemperaturecontrolBuffer(inlet)Buffer(outlet)MechanicalsteppermotorDeionizedwatersampletubes33步骤1毛细管灌胶每次电泳前毛细管都会灌胶，替换已经用过的旧胶，不会污染新的样品34步骤2样品盘移动样品盘X、Y、Z三维移动􀁺支持96孔或384孔样品盘􀁺有专门的盛