64第五章 cDNA文库的构建

第五章cDNA文库的构建和筛选•以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。1.cDNAmRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物2.cDNAlibrary利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。•cDNA文库的特点1.基因特异性来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息：2.器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。4.不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。5.各cDNA均可获得表达•建立cDNA文库的一般程序1.mRNA的分离与纯化载体DNA片段的制备。2.双链cDNA的合成。1）单链cDNA的合成：反转录法2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子3.cDNA克隆载体的制备。4.ds-cDNA与载体DNA相连。5.重组cDNA分子的导入和克隆。第一节将RNA转变成cDNA一、mRNA的分离纯化1.总RNA的提取•RNA不稳定：核糖环上的2`－OH促使对磷酸二酯键的亲水性攻击。•异硫氰酸胍法：异硫氰酸胍可裂解细胞，使RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）为RNA，有机层（黄色）为DNA和蛋白质。RNA酶的降解RNA分子不稳定RNA易遭降解RNA分子结构RNA抽提2、mRNA的分离纯化•mRNA只占总RNA的1%-5%。•原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA中分离纯化。•方法：寡聚（dT）-纤维素柱层析法。mRNA纯化二、cDNA合成•cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。•第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligodT。•第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。cDNA的第一链合成•反转录：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。•禽类成髓细胞瘤病毒（AMV)的反转录酶一类能引起鸟类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。其反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成，有二种酶活力。1）RNA指导的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。•莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反转录酶此酶是一条单一的多肽链，有RNA聚合酶的活性，RNaseH的活性减弱。•引物1、OligodT引物2、随机引物（六聚体寡核苷酸）这种非特异性引物可沿着mRNA多个位点结合3、特异性引物。反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTT在总的RNA中可作为具有mRNA的特异引物文库不能完全包含基因编码序列产生一个大的具有特定序列的cDNA文库cDNA产物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用可产生大量特定基因的cDNA文库产生的cDNA文库应用范围有限•第一链合成过程mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物或RNaseH碱第二链合成•剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’•用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉）。核酸酶S1cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’cDNA合成缺点：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。•改进•RNaseH酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。•小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。•DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’RNaseHDNAligase去引物cDNA末端修饰•借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。•在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶•加人工接头三、cDNA克隆载体•如果用功能测定来筛选目的基因，可用质粒载体来构建cDNA的表达文库。•如果通过分子杂交或抗体筛选目的基因，可用噬菌体载体构建cDNA文库。•λ噬菌体载体－λZapcDNA载体•λZapcDNA载体•优点：1、高的转染效率2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的质粒表达载体。•含有一个真核启动子•λZapcDNA载体的噬菌粒营救第二节cDNA文库的筛选•表达分析•核酸原位杂交1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针；2、纯化蛋白质的相应抗体探针；3、差异表达的扣除cDNA探针。一、简并寡核苷酸探针•简并探针：是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。•在探针库中，只有一种与目的基因完全互补。•一般为17个核苷酸，序列相同，碱基组成不同。•杂交时借助一定浓度氯化四甲铵控制解链温度（Tm)。操作过程•简并探针的假阳性•由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。方法：1、制备“猜测体探针”2、PCR猜测体技术•解决方法：1）制备“猜测体探针”•一种人工合成的用于分离克隆基因的低简并性的寡核苷酸探针，其核苷酸序列是根据特定物种当中某种已知蛋白质的密码子使用频率，同时又采纳了根据猜测最可能在目的基因中出现的密码子资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行合成。•较长的唯一的寡核苷酸序列，它能够大范围的却不能够完全的同靶序列互补。2）PCR猜测体技术步骤：1、根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物；2、以cDNA为模板；对目的基因特异性扩增；3、产物连接到载体上克隆，用唯一猜测体探针杂交，选择阳性克隆；4、分离的克隆中部为32氨基酸序列，两侧为引物序列；5、用这段插入序列为探针，筛选噬菌体cDNA文库。根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物，以cDNA为模板，进行扩增用猜测探针杂交筛选阳性克隆PCR-猜测体探针二、抗体探针利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。•抗体鉴别阳性克隆•用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。三、差示杂交•需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针)平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。差别杂交的局限性：1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显。2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。四、扣除杂交•原理：去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA操作：•从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。•将表达A蛋白的总mRNA合成cDNA第一链；作为探针群同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。•不能杂交的cDNA即为特异表达的A基因的cDNA单链。•用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA羟磷灰石柱BAPCRcDNA文库分离缺失突变的目的基因第三节cDNA表达文库的功能筛选一、蛋白质活性分析1、真核的表达文库组成混合池，转染动物细胞，鉴定目的基因的功能，筛选出目的基因的克隆重组体。2、功能性探针筛选噬菌体表达文库。3、定向克隆cDNA库，体外转录mRNA,再将其注导入适当的寄主细胞，分析表达蛋白质功能。二、酵母双杂交系统•又叫相互作用陷阱，有效的分离能与已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。•应用范围：鉴定新的蛋白与蛋白相互作用；鉴定蛋白级联底物；鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响；在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质。基本原理：•许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成；•应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。例：•酿酒酵母的半乳糖苷酶基因（lacZ)的转录激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸区段有一个DNA结合域（DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸区段有一个转录激活域（AD），DNA-BD能识别上游激活序列（USA)并与之结合；AD通过同转录机制中的其它成份之间的结合作用启动USA下游基因进行转录。•用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中表达，它们不能激活lacZ基因进行转录。•组成元件1.用于筛选的报告基因lacZ（寄主基因组内）；2.pGBT9(DNA-BD载体)：插入了BD和诱饵基因；3.pGAD424(AD载体)：插入AD基因和待测的靶蛋白基因。•外源基因都按正确的取向和读码结构插入在载体的MCS内，表达的靶蛋白和诱饵蛋白分别会同BD和AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质。寄主菌株：剔除掉GAL4基因的酿酒酵母酵母双杂交文库筛选策略•优点：•快速获得相互作用蛋白的基因；•只需单一步骤的质粒构建；•在体内鉴定蛋白的相互作用；•弱小的，暂时的相互作用也能鉴定；•能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号。•缺点：(1)双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。(2)容易出现“假阳性”。通常由以下原因造成:•prey蛋白的非特异性结合；•无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。三、cDNA噬菌体展示•将编码特异蛋白的基因序列插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与外源蛋白质相互作用的蛋白质。PIII基因型表达型•实验策略•构建一个含靶蛋白的噬菌粒载体•M13助噬菌体•供体大肠杆菌（寄主细胞）•筛选方法•被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，此叫“多肽文库”。•将靶蛋白分子固定于固相上，与“肽库”经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后洗脱与靶分子结合吸附的噬菌体，收集并感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱。•经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。•常用的免疫抗体•优点•淘选的高效率使得在极低的存在水平下，可挑选到高亲和力噬菌体；•所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；•展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。第四节用克隆cDNA作为反应物一、RNA印迹二、R