蛋白质测定的意义-蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品...

食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）蛋白质测定的意义蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。蛋白质测定的方法蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一,应用普遍。此外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，国外采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）一、凯氏定氮法新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定，由于样品中含有少量核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。该法分常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等多种方法。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）1、常量凯氏定氮法⑴原理将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为NH3，并与H2SO4结合成NH4SO4，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使NH3游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使NH3蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑵适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。⑶试剂①浓硫酸②硫酸铜③硫酸钾④氢氧化钠溶液：400g/L⑤硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。⑥HCl标准溶液：0.1000mol/L。⑦甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份2g/L溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑷主要仪器如图，凯氏烧瓶（500mL)定氮蒸馏装置。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）准确称取固体样品0.20~2.00g（半固体样品2.00~5.00g，液体样品10.00~25.00mL），小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入研细的0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20ml浓硫酸，小心摇匀后，按图安装消化装置，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化）。①样品消化先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，再继续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）②蒸馏、吸收按图装好蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内加入100mL蒸馏水约2/3处、玻璃珠数粒，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装有10mL20g∕L硼酸溶液及混合指示剂1~2滴）。准确吸取10mL样品处理液由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）③滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1000mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。⑹结果计算式中Ｘ----蛋白质的含量，g/100g；c----硫酸或盐酸标准溶液的浓度，mol/L；V1----滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；V2----滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；m----样品质量g，g；0.0140----1.0mL1.000mol/L硫酸（1/2H2SO4）或盐酸标准溶液相当的氮的质量，g/mmol；F----氮换算为蛋白质的系数。100100100140.0)(21FmVVcX食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）2、微量凯氏定氮法⑴原理同常量凯氏定氮法。⑵主要仪器凯氏烧瓶（100mL）微量凯氏定氮装置（如图）⑶试剂0.01000mol/L盐酸标准溶液，其他试剂同常量凯氏定氮法。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑷操作方法①样品消化：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。②蒸馏：按图装好微量定氮装置，准确量取消化稀释液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL400g/L氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL40g/L（或20g/L）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法的基础，但操作费时，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境，影响操作人员健康。而分光光度测定法不仅能满足对工艺过程的快速控制分析，而且具有环境污染少，操作简便省时等特点。⑴基本原理：食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在pH=4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。二、蛋白质的分光光度测定法食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑶试剂①氢氧化钠溶液：300g/L。②乙酸：1mol/L。③对硝基苯酚指示剂溶液：④乙酸钠-乙酸缓冲溶液：pH=4.8。⑤显色剂：15mL37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL,剧烈振摇，混匀（室温下放置稳定3日）。⑵主要仪器：分光光度计；电热恒温水浴锅（100±0.5）℃；10mL具塞玻璃比色管。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑥氨氮标准贮备溶液：1.0g/L。精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.472g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀。此溶液每升相当于1.0mgNH3-N（10℃下贮存稳定1年以上）⑦氨氮标准使用溶液：0.1g/L。用移液管精密吸取10mL氨氮标准贮备溶液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100μgNH3-N。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑷操作方法①精密称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1~0.5g或半固体试样0.2~1.0g，或吸取液体试样1~5mL，移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）②精密吸取2~5mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1~2滴对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。③精密吸取0.0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于0.0μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60μg、80.0μg、100.0μgNH3-N），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于400nm波长处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）④精密吸取0.5~2.0mL（约相当于氮小于100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于波长400nm处测量吸光度。试样吸光度与标准曲线比较定量求出含量。食品中蛋白质含量的测定食品安全检验技术（理化部分）⑸结果计算式中X----试样中蛋白质的含量，g/100gg/100mL；m1----试样测定液中氮的量，μg；m2----试剂空白测定液中氮的量，μg；V1----试样消化液定容体积mL，；V2----制备试样溶液的消化液体积，mL；V3----试样溶液总体积，mL；V4----测定用试样溶液体积，mL；m----试样质量（或体积），g（或mL）；F----氮换算为蛋白质的系数。FVVVVmmmX100106341221