影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤

影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤魏理文1（113200900900032）陈智源1（113200900900030）蒲雨濛1（113200900900031）夏骏康1（113200900900033）黎耀涛1（113200980140011）指导老师：周翔2、徐小元2(1.南方医科大学公卫学院09级预防医学2.南方医科大学基础医学院实验教学中心,广州510515)摘要：目的：强化颈动、静脉，输尿管插管技术和家兔肾缺血再灌注损伤模型的复制方法；加深理解尿生成的机理及肾排泄功能的重要意义；了解缺血再灌注损伤的机制及其基本实验方法。方法：家兔麻醉后分别行颈静脉插管术颈动脉插管术和输尿管插管术，静脉分别补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖，观测平均动脉压，尿量收集尿液测尿肌酐含量；结扎左肾动脉，一段时间后松开动脉夹再灌注，观测平均动脉压，尿量，收集尿液测尿肌酐含量，计算内生肌酐清除率(Ccr)。结果：补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖尿生成量增加，缺血再灌注后尿肌酐浓度降低,内生肌酐清除率(Ccr)降低。结论：增加血容量，肾滤过血液增多，尿生成增加；注射高渗溶液增加原尿浓度，尿生成增加；缺血再灌注后肾排泄能力降低，肾的功能受损。关键词：尿生成；肾脏；尿肌酐；缺血再灌注损伤肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。1材料与方法1.1材料：1.1.1主要试剂与仪器：20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，蒸馏水，速尿剂，肌酐测定试剂（含试剂一、试剂三、试剂四）。医用计算机记录系统（PcLab）及计算机，家兔手术台，哺乳动物手术器械，动脉静脉输尿管插管，压力换能器，三通管，注射器，兔绳，纱布，剪刀，分光光度计，恒温水浴箱，试管，微量加样枪带枪头，称重称。1.1.2实验动物:家兔，体重1.2kg，由南方医科大学提供。1.2方法：1.2.1准备工作家兔称重1.2kg，用20%乌拉坦6ml耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部备皮，沿甲状软骨下正中剪开皮肤，分离右侧颈总静脉并从右侧颈总静脉插入静脉导管。动脉插管用肝素充盈，分离左侧颈总动脉并左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录平均动脉压ABP。家兔耻骨下联合备皮后沿前正中线剪开皮肤，找到输尿管并进行输尿管插管并用有刻度的试管收集尿液。1.2.2研究尿生成过程影响因素静脉推注37℃，30ml生理盐水，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量（ml/分钟）；一段时间后静脉输入37℃，10ml20%葡萄糖溶液，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。收集的尿液待测尿肌酐含量。1.2.3肾缺血再灌注损伤的实验将家兔换成右侧卧位，游离左肾动脉，用动脉夹夹闭，并观测平均动脉压和尿量变化，夹闭30min后观测平均动脉压和尿量变化。松开动脉夹，再灌注，同时静脉输入49ml生理盐水加1ml速尿，再灌注30min后取尿测定尿肌酐浓度，记录平均动脉压和尿量变化。收集尿液待测尿肌酐含量。1.3尿肌酐测定方法1.3.1取样：取尿液10μl与2ml蒸馏水按1：200比例稀释。1.3.2加样表1.尿肌酐测定加样量表1.3.3测定37℃10min水浴，以蒸馏水调零，测510nm处光密度。1.3.4计算尿肌酐(mmol/L)=（测定管OD-空白管OD）/（标准管OD–空白管OD）x标准品浓度x201倍内生肌酐清除率Ccr=尿肌酐浓度/血肌酐浓度x尿量(ml/min)1.3.5参考值血肌酐浓度：正常：152.3umol/L30min：175.6umol/L标准品浓度：10umol/L加样（ml）标准管测定管空白管测试样品上清01.60试剂一(Cr标准品)1.600蒸馏水001.6试剂三0.50.50.5试剂四0.50.50.52实验结果2.1血压记录结果输入30ml生理盐水后，血压上升；一段时间后输入10ml，20%葡萄糖，血压略上升但不明显；动脉夹闭即刻血压略降；缺血30min后血压下降，再灌注并注射后血压上升。表2.实验各期收缩压和动脉压记录结果统计输尿管插管后输入生理盐水后输入20%葡萄糖后夹闭左肾动脉即刻夹闭左肾动脉30min后再灌注并注射30min后收缩压110mmHg138mmHg121mmHg106mmHg98mmHg108mmHg舒张压78mmHg94mmHg84mmHg73mmHg65mmHg78mmHg平均动脉压87.6mmHg107.2mmHg95.1mmHg82.9mmHg74.9mmHg87mmHg2.2尿量记录输入生理30ml盐水后，尿量增加，输入10ml，20%葡萄糖后，尿量增加更明显。表3.实验各期尿量收集结果实验期输尿管插管后输入生理30ml盐水后输入20%葡萄糖后夹闭左肾动脉即刻夹闭左肾动脉30min后再灌注并注射30min后尿量0.3ml/min0.6ml/min1.3ml/min0.3ml/min0.05ml/min2.0ml/min2.3尿肌酐含量测定数据注射生理盐水后尿肌酐含量明显下降，注射糖水后尿肌酐含量急剧上升。缺血再灌注后尿肌酐浓度大幅下降。缺血再灌注后的Ccr较缺正常状态明显降低。表4.输尿管插管后尿肌酐含量测定表表5.注射30ml生理盐水后尿肌酐含量测定表表6.注射10ml，20%葡萄糖后尿肌酐含量测定表表7.肾再灌注并注射盐水和速尿30min后尿肌酐含量测定表标准管空白管测定管OD值一0.1080.0630.248OD值二0.1080.0650.249OD值三0.1060.0640.240平均值0.10730.06400.2457标准管空白管测定管OD值一0.0980.0710.164OD值二0.0980.0660.160OD值三0.0970.0710.161平均值0.09770.06930.1617标准管空白管测定管OD值一0.1360.1110.302OD值二0.1330.1090.294OD值三0.1340.1120.296平均值0.13430.11070.2973标准管空白管测定管OD值一0.1070.0620.070OD值二0.1080.0630.072OD值三0.1030.0620.071平均值0.10600.06230.0710表8.实验4期尿肌酐含量计算结果表表9.正常时和缺血再灌注后内生肌酐清除率计算结果表3讨论：1.静脉快速注射30mlNS可使家兔尿量增加血压上升，其机制可能为：①静脉快速注射NS使血浆胶体渗透压降低，肾小球的率过滤升高，尿量增多；②同时也使循环血量增多，作用于左心房和胸腔大静脉壁上的容量感受器，通过迷走神经反射性地抑制血管升压素的合成和分泌，远端肾小管和集合管对水的重吸收减少，尿量增多，排出体内过多水分，使循环血量得以恢复。③循环血量的增加可刺激容量感受器，血压升高可刺激压力感受器，二者均可使迷走神经传入冲动增加，反射性的抑制抗利尿激素（ADH）的分泌和释放，使水的重吸收减少。循环血量增多使心房扩张和摄入钠过多时还可刺激心房钠尿肽合成，通过抑制集合管对NaCl的重吸收、促进入球和出球小动脉的扩张（以前者为主）以及抑制肾素、醛固酮和抗利尿激素的分泌，使水的重吸收减少。2.静脉注射20%葡萄糖可使家兔血压上升，尿量增加。其机制为：①静脉注射20%葡萄糖10ml可使血浆渗透压升高，促进组织也流入毛细血管，循环血量增加引起血压升高。②1.2kg的家兔，血容量约为72ml，血糖浓度为40mg/dL，而一次性注射20%葡萄糖10ml，血糖升至约1200mg/dL，使家兔的血糖浓度明显超过肾糖阈，导致小管液中葡萄糖含量增多，小管液渗透压增高，妨碍了水和NaCl的重吸收，造成尿量增多并出现糖尿。③另外血压升高可使肾小球滤过率增高且反射性抑制ADH的合成和分泌，也可使尿量增多。3.肾缺血再灌注损伤机制为：①夹闭左肾动脉后，缺血期组织含氧量减少，作为电子受体的氧不足，当再灌注提供氧的同时，也提供的大量电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多。其中包括线粒体产生活性氧增加、血管内皮细胞黄嘌呤氧化酶形成增加、白细胞呼吸爆发产生大量活性氧、儿茶酚胺的自身氧化、诱导型NOS表达增强、体内清除活性氧能力下降等因素都导致活性氧的大量产生，这些活性氧攻击细胞，造成膜脂质过氧化，蛋白质分子氧化而发生变性，聚合，降解或肽键断裂，从而使酶，受体，离子通道等产生功能障碍。此外活性氧还可以攻击核酸，造成碱基修饰，断裂和交联，造成细胞功能障碍。②缺血再灌注后大量产生的活性氧破坏细胞质膜和细胞器膜，缺血时细胞膜外板与糖被分离，使细胞膜对钙的通透性大大增加。再灌注时钙离子顺细胞内外的浓度差大量进入细胞内，又可激活磷脂酶使膜磷脂降解，细胞通透性进一步增高形成恶性循环，加速钙离子进入细胞内。另外钠离插管即刻注射30ml盐水注射10ml糖再灌注30min尿肌酐浓度（umol/L）8434.66540.615892.6400.1正常缺血再灌注后Ccr(ml/min)16.614.56子和钙离子的交换增加和儿茶酚胺增多都可引起细胞内钙超载二损伤细胞使线粒体ATP合成减少，线粒体通透性转运孔道开放，激活钙依赖性降解酶，促进活性氧生成，破坏细胞骨架等。③缺血期产生的代谢产物蓄积、组织细胞碎片等均可触发急性炎症反应，再灌注时氧和营养物质的供应，大量白细胞随血流进入组织加剧了炎症反应。缺血再灌注使肾内趋化因子生成增多，细胞粘附分子表达增多，致使白细胞聚集，大量的白细胞聚集在再灌注区，阻塞微循环，释放活性氧，释放各种颗粒成分，产生各种致炎性细胞因子，总之，白细胞活化后产生的各种趋化物质可以促使更多的白细胞聚集，引起微循环障碍，聚集的白细胞释放活性氧和各种生物活性物质，使炎症反应失控，并造成组织的损伤。④机体生命活动所需的能量均依赖于高能磷酸化合物的供给，短时间缺血后细胞合成ATP的能力在再灌注后很长时间才能恢复，缺血再灌注区ATP生成能力下降的机制为线粒体受损和ATP合成的前身物质减少。再灌注后通过以上的四种机制肾组织受到损伤，造成肾滤过功能障碍，引起血肌酐的浓度增加和尿肌酐浓度降低。4.静脉注射速尿可使家兔尿量大幅增加。其机制为：呋塞米可与髓袢升支粗段的Na+-K+-2Cl-共同转运系统可逆性结合，抑制其转运能力，使NaCl重吸收减少，降低了肾脏的稀释功能，同时使髓质间隙渗透压降低，也降低了肾脏的浓缩功能，从而产生迅速而强大的利尿作用，排出大量等渗尿。5.再灌注并注射盐水和速尿30min后血压上升，机制可能为：①再灌注时注射了49ml的生理盐水使血容量较缺血期大幅增加。②缺血再灌注可能导致了肾前性急性肾衰竭的发生，由于夹闭左肾动脉使肾血液灌流量急剧减少，引起醛固酮和血管升压素增多，心房钠尿肽分泌减少，使肾小管对钠、水重吸收增多，出现钠、水潴留导致血容量增多，引起心排血量增加；肾缺血使钠离子和氯离子重吸收减少，次级致密斑通过信号转导使肾小球旁细胞分泌肾素，引起血管紧张素II增多，导致肾血管收缩（肾-球反馈），肾素-血管紧张素系统活性增强使外周阻力升高；肾合成PGE2、PGA2的等扩血管物质减少，引起血管收缩，进一步提高外周阻力。以上三点可以引起肾性高血压，它能增加肾小球毛细血管张力，增加肾小球的滤过负荷，加速肾小球硬化。6.尿肌酐含量变化原因：肌酐是肌肉代谢的产物，肌酐主要由肾小球(肾脏的重要组成部分)滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。在肉类食物摄入量稳定时．身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定