10、纳米诊断试剂

第10章纳米诊断试剂生物学及生物医学的飞速发展对传统的检测及诊断方法提出了新的挑战，要求建立活体(invivo)、原位(insitu)、实时(realtime)、动态(dynamic)的检测及诊断新方法。传统的光、电生物化学传感器已不能适应这些新的要求，使用这些传感器经常会导致生物学损伤及相关的生化恶果。因此，发展新型、无创、实时、动态检测及诊断探针已经成为人们的一个研究热点。近年来，随着纳米技术的迅速发展，以纳米粒子为基础的新型生物传感技术不断涌现，这些新型生物传感器，不仅可以解决一些生命活动中的重大问题，还将在疾病的早期诊断及治疗中发挥巨大的作用。国家863计划将生物和现代农业技术领域中的纳米生物技术研究集中在医用纳米生物传感器和成像技术、纳米药物制剂或载体、纳米生物农药等三个方面[1]。目前已开发出基于荧光纳米颗粒的白血病、红斑狼疮和某些癌症的早期诊断方法，用这样的生物纳米试剂诊断白血病比现有试剂的灵敏度高数千倍[2]。用于疾病早期诊断的纳米试剂很多，如半导体量子点、纳米金及磁性纳米粒子纳米诊断试剂等。本章前三节将重点介绍这三类纳米粒子及其诊断试剂的最新研究进展，第四节将简要介绍其它纳米诊断试剂的进展情况，最后一节介绍芯片技术在疾病诊断中的应用。10.1量子点及其在医学诊断中的应用10.1.1引言量子点是三维受限的、近似球状的无机半导体纳米晶体，尺寸通常在2-8nm之间，由200-10000个原子组成[3]。与传统的有机荧光染料相比，荧光量子点具有极其优良的光谱特性：(1)发射波长可通过控制它的粒径大小和组成来“调谐”，大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布，谱峰的半峰宽在30nm左右，且斯托克斯位移较大，因而几种不同发射波长的量子点用于不同靶点的同时监测时，可避免光谱干扰；(2)激发光谱范围宽，因而采用单个激发波长可同时激发不同发射波长的荧光量子点，而激发不同荧光染料，通常需不同的激发波长；(3)具有荧光量子产率高、光稳定性好等优点，适合于对标记对象进行高灵敏、长时间、实时动态观测；(4)具有空间兼容性，一个量子点可以偶联两种或两种以上的生物分子或配体[4-5]。自1998年Chan，Bruchez等人首次将量子点用于生物体系研究以来[6,7]，量子点作为一种新型荧光诊断试剂，在生物、药物以及生物医学等领域显示出巨大的优势，并且得到了越来越广泛的应用(如图10－1所示[8])。到目前为止，人们已经发展了多种量子点表面修饰及偶联方法，可以将量子点与一些生物识别分子如蛋白质、多肽、核酸、小分子等偶联。同时，以量子点为基础的多功能材料的制备也得到了长足的发展。最近，Science、NatureBiotechnology等多个国际著名杂志发表了关于量子点诊断试剂方面的评论性文章，评述了量子点的最新应用进展[9,10]。下面介绍量子点及其诊断试剂在一些疾病诊断与治疗方面的进展情况。10.1.2量子点的发光机理通常在半导体材料中，只有极少数电子填充在导带，绝大部分电子填充在价带，使价带几乎处于全满状态。当加热、加电压或光照等外界刺激时，一些电子会从价带跃迁到导带，在价带中形成空穴，空穴通常被认为是带有一个正电荷的离子。电子和空穴通过库仑引力互相“键合”，形成准粒子，这种互相“键合”的准粒子被称为“激子”[11]。激子被认为是一种类氢粒子，因而可用玻尔近似方法计算激子中电子-空穴之间的距离，其计算公式如下：r=εh2/πmre2r表示激子中电子-空穴的距离，ε是半导体的介电常数，mr是电子-空穴对的约化质量，h是普朗克常数，e表示电子的电荷。不同的半导体具有不同的激子玻尔半径，对于大多数半导体而言，其激子玻尔半径在1~10nm之间。由于量子点的半径小于或接近激子玻尔半径，其带隙随着量子点尺寸的变化而变化。随着量子点半径的减小，带隙逐渐增大，伴随着激子吸收峰的位置发生紫移，其荧光发射光谱也会发生紫移。Brus等人曾经提出一个公式用于计算不同大小量子点的带隙[12]。Eg(quantumdot)=Eg(bulk)+(h2/8R2)(1/me+1/mh)–1.8e2/4πε0εREg(quantumdot)表示量子点的带隙，Eg(bulk)表示体相材料的带隙，R是量子点的半径，me表示电子的有效质量，mh表示空穴的有效质量，ε0表示真空介电常数，ε表示半导体的介电常数。对于CdSe量子点而言，当其半径从1nm变化到3.5nm时，其荧光发射峰将从450nm红移到650nm。另外，不同组成的量子点，其发射光谱也不同。Nie等人研究发现，对于半径2.5nm的不同组成的CdSexTe1-x量子点，其荧光发射峰将从610nm变化到800nm[13](见图10－2)。1998199920002001200220032004200501020304050607080文章数目年份图10－1近几年量子点在生物、药物以及生物医学等领域应用发表文章数目（2005年仅统计了1-9月份的数据）。10.1.3量子点的制备方法高质量量子点的制备是生物标记、医学诊断以及疾病治疗的基础，如何制备发射波长窄而可调、量子产率高、性能稳定的量子点一直是材料科学家追求的目标和关注的热点。1993年，Bawendi课题组[14]采用有机金属盐高温反应体系合成了高效发光的CdSe量子点纳米晶体，用氧化三辛基瞵(TOPO)作为有机配位溶剂，二甲基镉[(CH3)2Cd]和TOPSe(TOP为三辛基膦)分别作为Cd和Se的前体，在340~360℃高温条件下反应，得到较高质量的CdSe量子点。经过尺寸选择性沉降后，可以提高量子点的单分散性，所合成量子点的量子产率约为10%，通过改变反应温度、反应时间等条件，可以调节量子点的粒径(2.4～23nm)。然而由于[(CH3)2Cd]和TOP等试剂有剧毒、不稳定，因而实验条件要求苛刻。2001年，Peng课题组[15]采用CdO代替(CH3)2Cd，制备出高质量的CdS、CdSe、CdTe量子点，并对CdSe量子点的成核规律进行了详细的研究，这种方法制备量子点具有制备方法简单、可制备的量子点种类多、并可用多种手段控制粒径分布。但这种方法因采用TOP或三丁基膦(TBP)等一些剧毒、极易燃、易爆的化合物为原料从而导致的合成条件仍比较苛刻，在实验过程中必需使用手套箱，针对以上问题，本课题组采用一种更安全、廉价的试剂代替原有试剂，无需手套箱就可制得高质量的CdSe量子点[16]。尽管采用目前的技术已经能够制备出高质量的CdSe量子点，然而，将CdSe量子点转移到水相之后，其荧光几乎完全被猝灭。相比之下，核-壳量子点具有更好的稳定性，将CdSe/ZnS核-壳量子点转移到水相之后，量子点仍然能够保持较高的荧光量子产率。目前，CdSe/ZnS核-壳量子点在生物体系中得到广泛的应用。1996年，Hines和Guyot-Sionnest[17]采用二甲基锌和六甲基二硅硫烷为原料，成功合成了CdSe/ZnS核-壳量子点。然而，由于原料中采用了易燃、易爆的金属有机化合物二甲基锌，从而限制了该方法的广泛应用。针对该方法所存在的缺陷，武汉大学Xie等人[18]采用醋酸镉和醋酸锌等简单的无机盐代替金属有机化合物，在相对温和、安全的条件下，成功制备出CdSe/CdS和CdSe/ZnS核-壳量子点。采用此方法，原料稳定、易于储存、成本低廉，使实验室大规模制备成为可能。图10－2CdSe量子点及CdSeTe量子点荧光性质随组成及尺寸的变化。A：CdSe量子点荧光发射光谱随尺寸的变化；B：半径为2.5nm的CdSexTe1-x量子点荧光发射光谱随组成的变化[6,13]。最近研究发现，CdSe-ZnS掺杂量子点[19]及CdSe/CdS/ZnS核-壳-壳量子点[20]比CdSe/ZnS核-壳量子点具有更好的稳定性，预计不久的将来，这些新型的量子点将会代替目前使用的CdSe/ZnS核-壳量子点，用于生物医学分析。10.1.4水溶性量子点的制备由于在高温有机溶剂中合成的量子点表面被一些烷基链保护，所合成的量子点仅仅溶于非极性或弱极性有机溶剂，如正己烷、氯仿等。使用前一般需要对量子点表面进行修饰，使其表面覆盖极性的基团，从而能够分散在水或缓冲溶液中。到目前为止，已经发展了多种制备水溶性量子点的方法。一般来说，可以分为两类：一类方法是将量子点表面的试剂用修饰试剂取代；另一类方法是通过两性聚合物与量子点表面作用，改变量子点表面的极性，从而使量子点能够分散在水或缓冲溶液中。1998年，Nie课题组[6]发明了用巯基乙酸修饰量子点的方法，成功将量子点从有机溶剂转移到水中。此后，巯基丙酸、巯基乙醇等一些带巯基的试剂均用来制备水溶性量子点。由于巯基上的Ｓ容易与Cd或Zn作用，而极性羧基可以增加量子点的水溶性，用这些简单的巯基试剂修饰量子点具有操作简便、成本低、重复性好等优点，然而，所制备的量子点稳定性并不太好。Bruchez等人[7]采用硅烷化试剂修饰量子点，有效地解决了稳定性的问题，但其制备过程非常复杂，不易重复。其它的修饰方法如二硫苏糖醇(DTT)[21]、二氢硫辛酸(DHLA)[22]、枝状有机化合物[23,24]等均在不同程度上增加了量子点在水溶液中的稳定性，但这些方法同样存在操作复杂、所制备的水溶性量子点量子产率低等不足。2002年，Dubertret等人[25]采用磷脂胶束直接与量子点表面的憎水基团(如：TOPO)作用，成功制备出高量子产率的水溶性量子点，这种方法操作简单，重复性好，所制备水溶性量子点的稳定性好，但由于磷脂胶束不易合成，限制了此法的推广及应用。Osaki等人[26]采用类似的方法，成功将多糖修饰到量子点表面，并制备出不同大小的微球。最近，Gao等人[27]将高分子共聚物吸附在量子点表面的憎水基团上，所制备的水溶性量子点稳定性好，当pH值从1变化到14，盐浓度从0.01mol/L变化到1.0mol/L时，量子点的光学性质不发生改变。可以预计，利用两性聚合物制备水溶性量子点的方法将是未来的发展趋势(见图10－3)。图10－3多功能水溶性量子点的结构示意图，其表面修饰的分子有TOPO、两性共聚物、肿瘤识别试剂(如：蛋白质、抗体、小分子抑制剂等)及聚乙二醇[6,27]。10.1.5量子点诊断试剂的制备采用巯基羧酸制备的水溶性量子点，在中性缓冲溶液中其表面带有很多负电荷，因而可以通过静电引力将带有正电荷的分子如：亲和素、锌指蛋白[28,29]等吸附到量子点表面。再将生物素化的分子与亲和素修饰的量子点结合，锌指蛋白用于分离未结合的分子。一些含有氨基或巯基的生物分子可以直接与量子点表面的Cd或Zn配位，取代量子点表面的修饰分子。另外，共价偶联也是制备量子点诊断试剂的一种方法，一些偶联试剂如：1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)[6]、丁二酰亚胺基-4-马来酰亚胺基环己烷-1-羧化酯(SMCC)[30]等常用于生物分子与量子点偶联。10.1.6量子点在疾病诊断及治疗中的应用10.1.6.1量子点用于基因芯片病毒测定人类疾病基因型的确认以及病毒的检测，主要依赖于相关核酸及蛋白质的测定。生物芯片技术在基因型病毒的检测上具有高通量、方便、试剂用量少等优点[31]。量子点以其独特的优越性在生物芯片中具有广阔的应用前景。Parak等人[30]用sulfo-SMCC偶联试剂将表面带有巯基的硅烷化量子点与氨基修饰的单链DNA偶联，将其与固定在玻片表面的DNA杂交，他们发现当玻片上的DNA与量子点偶联的DNA互补时，可以观察到量子点结合到玻片表面，反之则观察不到这种现象。Gerion等人[32]将DNA标记的量子点进一步用于DNA芯片的研究，表明DNA标记的量子点可在芯片上进行单核苷酸多态性(SNP)分析以及多色杂交，并对杂交条件进行了优化，这是首次将不同颜色量子点标记的DNA探针用于芯片杂交检测。在此基础上，他们将DNA标记的量子点用于乙肝、丙肝病毒的检测，取得了较好的效果。这使量子点同时高灵敏度检测多种病原体成为可能，例如：同时检测甲、乙、丙、丁、戊肝病毒以及艾滋病毒等。在