康为世纪microRNA及其荧光定量PCR检测讲座

microRNA及其RealtimePCR检测北京康为世纪生物技术有限公司康为世纪生物科技有限公司完善的产品线分子生物学全系列产品蛋白生物学产品免疫学相关产品一站式服务平台实验设计平台分子生物学平台蛋白表达与纯化平台抗体制备纯化平台免疫学检测平台北京康为世纪生物科技有限公司我们的客户我们的合作伙伴北京大学、清华大学、复旦大学中国科学院、军事医学科学院301医院、协和医院、上海瑞金医院华大基因、诺华制药•江苏泰州中国医药城•临床诊断试剂研发及中试平台•3000平米实验室及GMP厂房2009年microRNA,Ahotzoneofresearch!2010年microRNAmicroRNA（miRNA）–长度20～24nt单链小分子RNA–广泛存在于各种真核细胞中–不编码任何蛋白质–其基因常位于基因组非编码区–内源性表达，表达具时序性和组织特异性。–与目标基因mRNA相互作用，调控其表达水平–在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作分子功能•∼22nt单链小RNA•与目标基因3’端非编码区的识别位点相结合•导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5‘脱帽），从而表达水平下降3’AAAAAAAA5’capmiRNA作用靶点编码区mRNAmicroRNA的来源miRNA前体与成熟体microRNA识别靶点–不严格互补配对•一个miRNA可调节多个基因•一个基因可受多个miRNA调控•60%人类蛋白基因受miRNA调控miRNA与siRNA的异同•分子形式无区别，都是由Dicer产生的~22nt小分子•分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降。但通常siRNA效果更剧烈•产生来源不同。–miRNA有其基因，内源性表达–siRNA多数情况下为人工外源导入miRNAsiRNA命名规则–microRNA成熟体命名规则–microRNA成熟体•传统名字：如let7•家族成员：加a，b,c…后缀，如let-7a•主要产物：种名-miR-序号,如，has-miR-56•次要产物：加星号后缀，如，has-miR-56*•主次不明：以5’或3’端区分，如，miR-142-5p(5‘端产物)和miR-142-3p(3’端产物arm)(老命名miR-142-sandmiR-142-as.)miRNA分子功能总结•以非严格互补配对方式识别靶基因3’端非翻译区，只有~8nt的种子区（seedregion）严格互补配对•一种miRNA分子可以不同威力调控多个靶基因，通常导致靶基因mRNA稳定性降低及其它翻译水平的表达下降（如，脱帽）。通常不导致mRNA剧烈降解•有个别报告miRNAs与5‘端非翻译区结合导致靶基因上调表达•在植物中miRNA的分子功能可与siRNA相似，与目标靶点严格互补配对，导致目标基因mRNA分子急剧降解权威数据库miRBase年初数据库（v.14）包括物种：115人miRNA：721小鼠miRNA:579大鼠miRNA：325拟南芥miRNA：1902011年初数据库（v.16）包括物种：142人miRNA：1048小鼠miRNA:672大鼠miRNA：408拟南芥miRNA：213miRNAannotationAuniformsystemformicroRNAannotation.AmbrosV,BartelB,BartelDP,BurgeCB,CarringtonJC,ChenX,DreyfussG,EddySR,Griffiths-JonesS,MarshallM,MatzkeM,RuvkunG,TuschlT.RNA20039(3):277-279ExpressioncriteriaA.Detectionofadistinct∼22-ntRNAtranscriptbyhybridizationtoasize-fractionatedRNAsample(ordinarilybytheNorthernblottingmethod).B.Identificationofthe∼22-ntsequenceinalibraryofcDNAsmadefromsize-fractionatedRNA.Suchsequencesmustpreciselymatchthegenomicsequenceoftheorganismfromwhichtheywerecloned(exceptasnotedbelow).BiogenesiscriteriaC.Predictionofapotentialfold-backprecursorstructurethatcontainsthe∼22-ntmiRNAsequencewithinonearmofthehairpin.Inthiscriterion,thehairpinmustbethefoldingalternativewiththelowestfreeenergy,aspredictedbymfold(Mathewsetal.1999)oranotherconventionalRNA-foldingprogram,andmustincludeatleast16bpinvolvingthefirst22ntofthemiRNAandtheotherarmofthehairpin.Itshouldnotcontainlargeinternalloopsorbulges,particularlynotlargeasymmetricbulges.Inanimals,thesefold-backprecursorsareusuallyabout60–80nt,whereasinplants,theyaremorevariable,andmayincludeuptoafewhundrednucleotides.D.Phylogeneticconservationofthe∼22-ntmiRNAsequenceanditspredictedfold-backprecursorsecondarystructure.TheconservedhairpinshouldmeetthesameminimalpairingrequirementsasincriterionC,butneednotbethelowestfreeenergyfoldingalternative.E.DetectionofincreasedprecursoraccumulationinorganismswithreducedDicerfunction.miRNA检测与定量经典方法:放射标记Northern杂交miRNA芯片–基因表达谱•基本原理：某物种全部已知miRNA集中于一张芯片。点杂交检测各miRNA丰度•所回答的问题：哪些miRNA是你所应该关注的•优点：高通量，全景观察•缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛•需后续验证：qPCRmiRNA主要检测技术Pri-miRNA检测必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。SpecificmiRNAquantificationbyrealtimePCR–waytogo关键难点•太短–解决办法:加长•丰度低–解决办法:小RNA提取•序列高度相似miRNA之间难以区分–解决办法:特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化成熟miRNAqPCR检测-Poly(A)加尾法优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测成熟miRNAqPCR检测–茎环法优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测检测方法选择•依样本特性，检测目标多寡而定•康为技术服务经验举例：–复旦大学某客户•miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达•要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA•加尾法，5个目标获得良好检测•颈环法，4个目标获得良好检测•1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系其它检测原理其它检测原理microRNA检测难题解决miRNA丰度难题-小RNA提取基本原理影响RNA分子与硅胶柱结合的因素•chaotropicagent，如，盐酸胍•离子强度，如NaCl•小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNAM123M：Marker#1：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总RNA提取小分子量RNA康为miRNA产品小RNA提取试剂盒CW0627加尾法miRNAcDNA第一链合成试剂盒CW2141miRNA荧光定量PCR检测试剂盒CW2142康为miRNA检测服务全套miRNA检测：从生物样本到数据茎环法miRNA检测引物：定制谢谢！